抗凍蛋白和冰核蛋白對(duì)植物抗凍性能的作用機(jī)制

經(jīng)濟(jì)林研究 2009,27(2):125130NwdF經(jīng)濟(jì)林研究 2009,27(2):125130NwdFoestReseachΞ制樊紹,張黨,鄧順,明付煥(學(xué),南沙410004)摘:植物抗凍蛋白是避免植物寒害凍害發(fā)生的重要物,相對(duì)而,極地的魚(yú)類和昆蟲(chóng)的抗凍蛋白具有低熱滯活性和高重結(jié)晶抑制活性的特。冰核活性蛋白是由冰核活性細(xì)真菌或昆蟲(chóng)合成的生物冰核劑,,。分析了抗凍蛋白和冰,植物抗凍性能的復(fù)雜。關(guān)鍵:;;;;述中圖分類:文獻(xiàn)標(biāo)識(shí):文章編:1003-8981(2009)02-0125-06Q51AMecnmofAntfreezeProenndceNceoproennPntAntfreezeActvyANao-ng,ANGDng-n,DENGhn-ng,MNGF-hn(KeyLabofNonwoodForestPoductsofStateForestryAmnstraton,CentralouthUnverstyofForestryandTechoogy,Changha410004,Hunan,Chna)Absac:Pantantfreeepotensakndofmportantmateralswhchaododandfoendmag.Cmparedwthfhesandnectsnpoarregon,pantantfreeepotenshavewhysteressactvtyandnhboryactvtyofhghrecrystallato.cenucopotensareboogcalcenuceiagentofactvebactera,fungiandnect,whchncreaeaquousoutontmperatureofcenuceiomatonnearyoolngstage,anddecreaeperoolngpontofwatertmperatur.Boogcalandpotencharacterstcsofantfreeepotenandcenucopoten,reguaorymechanmofoldlqudphaechangesofwatermoecueswereanayed,whchwasofgreatsgnfcancenrevealngmplcatedantfreeemechanmandpantantfreeepplcatonsofgenetcengneerngreearche.Keyord:perooln;antfreeepote;cenucopote;pantantfreeeactvty,lteraturerevw有關(guān)低溫科學(xué)研究的結(jié)果表明,純水在冰點(diǎn)(0℃)以下仍能保持液體狀態(tài)而不結(jié)冰,而體積非常微小的液滴(<10L)甚至可以冷卻至-39℃以下仍不結(jié)這種低于冰點(diǎn)溫度但不發(fā)生凍結(jié)的現(xiàn)象即是過(guò)冷卻(peroolng)在致冷因素持續(xù)作用下降至某溫度,過(guò)冷狀態(tài)迅速瓦解發(fā)生凍結(jié),該溫度即組織的過(guò)冷卻點(diǎn)(peroolngpont)。植物細(xì)胞水具有過(guò)冷卻作用,即使在-7℃或-8℃的低溫下也不結(jié)冰,生物體正是通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)的過(guò)冷卻點(diǎn)以適應(yīng)生存環(huán)境的,生物學(xué)研究中常把過(guò)冷卻點(diǎn)作為生物體抗寒性和抗凍性的重要評(píng)價(jià)指。收稿日:基金項(xiàng):作者簡(jiǎn):通訊作:20081120金(30700643)。剛(1983-),男,。,。權(quán)(1976-),男,。,,。Ema:hangdangquan@16.m。Ξ病血液等是自然界活性最強(qiáng)的冰核,病血液等是自然界活性最強(qiáng)的冰核,可使水在較高的亞低溫下(-～-5℃)都能結(jié)。植物抗凍蛋白AFP)是植物體經(jīng)低溫誘導(dǎo)后產(chǎn)生的一類具有熱滯活性和重結(jié)晶抑制活性的抗逆蛋白,普遍存在于越冬植物體內(nèi),通過(guò)抑制細(xì)胞外重結(jié)晶和控制冰晶生長(zhǎng),從而避免了大冰晶對(duì)機(jī)體的損。冰核蛋白(NPs)的存在提高了植物細(xì)胞水冰點(diǎn)溫度,使得冰核活性細(xì)菌具有在較高溫度(-～5℃)下形成規(guī)細(xì)、微小異質(zhì)冰晶的能。研究者發(fā)現(xiàn),冰核蛋白與抗凍蛋白在控制冰晶形態(tài)和抑制重結(jié)晶上有著異曲同工之處,比較兩者的生物結(jié)構(gòu)和作用機(jī),可為植物抗凍基因工程的研究和制定相應(yīng)的抗凍策略提供新的思。1植物抗凍蛋白.1植物抗凍蛋白的生物學(xué)特性早在20世紀(jì)60年代抗凍蛋白已被發(fā)現(xiàn),但直到1992年加拿大的Grffith等人1才第1次分離純化得到植物抗凍蛋。他們從經(jīng)過(guò)低溫誘導(dǎo)的冬黑麥中發(fā)現(xiàn)了由內(nèi)源產(chǎn)生AFPs,且從冬黑麥葉片的質(zhì)外體中提取并部分純化了這種蛋,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了其非依數(shù)性地降低水的冰點(diǎn)并改變冰晶的正常生長(zhǎng)模這一特性與之前發(fā)現(xiàn)的極地魚(yú)類和昆蟲(chóng)抗凍蛋白的特性相一?？箖龅鞍追且罃?shù)性降低水溶液的冰點(diǎn)(freezngpont,FP)而不影響熔點(diǎn)meltngpont,MP)的特性仍由溶液的依數(shù)性決定,從而導(dǎo)致熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)差值,即為熱滯活性(themalhysteresisactvity,THA),抗凍蛋白也因此被稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白(themalhysteresispotens,THPs)2。這種只影響結(jié)冰而不影響熔化的熱滯效應(yīng)就AFPs的重要特AFP還具有冰晶形態(tài)效應(yīng)和重結(jié)晶抑制(recrystallatonnhbiton,R)效應(yīng),AFP改變了冰晶在純水中以平行于晶格基面a軸的方式生,在低濃AFPs(moL)下優(yōu)先抑制冰沿a軸的生,高濃度下冰晶主要沿c軸生,形成六邊雙棱錐及針形晶體3并且,它可抑制冰晶重結(jié)晶的發(fā)生,使形成的冰晶小而均勻,防止大冰晶對(duì)細(xì)胞的傷植物AFPs的主要功能:即通過(guò)調(diào)整原生質(zhì)溶液的狀態(tài),降低過(guò)冷卻點(diǎn),避免植物體內(nèi)形成冰晶,抑制冰晶的重結(jié)晶和修飾胞外冰晶的生長(zhǎng)形。.2植物抗凍蛋白的功能特征就目前已被純化的胡蘿冬黑歐白黑麥沙冬青等植物抗凍蛋白而,其分子量與氨基酸組成各不相,個(gè)體之間幾乎沒(méi)有同源性,抗凍蛋白的多樣性為其科學(xué)研究和應(yīng)用提供了更大的選擇空。植物抗凍蛋白的TH活性低于魚(yú)類(.～.5℃),遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于昆,但植物AFPs的重結(jié)晶抑制活性比魚(yú)類和昆蟲(chóng)的AFPs要高出1～100因此,AFPs提高植物抗凍性的主要途徑不是阻止冰晶的形成,而是調(diào)控胞外冰晶的增長(zhǎng)及抑制冰的重結(jié)晶,一方面將冰晶的形成控制在細(xì)胞之,另一方面控制冰晶的形狀和重結(jié),使形成的冰晶小而均勻,避免冰晶增大而產(chǎn)生致死性的機(jī)械損。物抗凍蛋白同時(shí)具有抗抗病雙重功Dman從歐白英Solnmdulcmaa的冬季枝條中分離得到的富含甘氨酸分子量67Da的抗凍糖蛋白,半乳糖酶處理后其抗凍活性消,這表明半乳糖是該蛋白抗凍活性的關(guān)鍵組成部分4Grffith等人發(fā),冬黑Secaleceeale中有3AFPsN端序列與3種抗真菌蛋白(內(nèi)切幾丁質(zhì)內(nèi)切1,3葡聚糖酶和Thamatnlke蛋白)具有同源性,免疫檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng),這說(shuō)明冬黑中的抗凍和抗病反應(yīng)有著共同的或相似的反應(yīng)體江勇等人從沙冬Ammpptanthusmngolcus葉片中分離得到熱穩(wěn)定AFP,其中一AFGPN端20個(gè)氨基酸殘基為DDLSFNKVPQTDLF,他們發(fā),序列與植物凝集素有較高的同源性,但需要進(jìn)一步的研究5。1998年,英國(guó)York大學(xué)DwnWorrall等人發(fā)現(xiàn),胡蘿卜的抗凍蛋白由富含亮氨酸的重復(fù)序列組成,其序列編碼與多聚半乳糖酸酶抑制蛋白有很高的同源性,且他們首次得到了植物抗凍蛋白的編碼序列61999年,Mchae等人從桃樹(shù)Punuspesca的樹(shù)皮中提取到了一種脫水蛋白PA60,其由472個(gè)氨基酸組成,富含賴氨甘氨酸,分子量為50Da,具有較強(qiáng)的修飾冰晶的能,這是首次發(fā)現(xiàn)的具有脫水素蛋白特性的抗凍蛋白7。2000年,York大學(xué)的科學(xué)家們又在低溫誘導(dǎo)的黑麥Lolmpeenne中發(fā)現(xiàn)了具有熱穩(wěn)定性AFP,其由118個(gè)氨基酸組成,分子量為1.77Da,其熱滯值(.1～.45℃)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于魚(yú)類和昆蟲(chóng),但其對(duì)冰晶重晶化的抑制效應(yīng)是大洋條鱈的抗凍蛋白(Tpel)的200倍,100℃時(shí)仍穩(wěn)定存在82002年,Nely等人orogadusada中分離純化得到了一N端被甲基化AFG他們?cè)谝院舜殴舱窈透盗⑷~變換紅外光譜儀研究其動(dòng)力學(xué)構(gòu)象原中發(fā),AFGP無(wú)論在什么條件?1994-2013ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserv第2期樊紹剛:抗凍蛋白和冰核蛋白對(duì)植物抗凍性能的作用機(jī)制127下基本上都保持著一種相似的三維折疊結(jié)構(gòu),第2期樊紹剛:抗凍蛋白和冰核蛋白對(duì)植物抗凍性能的作用機(jī)制127下基本上都保持著一種相似的三維折疊結(jié)構(gòu),其水化作用和相對(duì)穩(wěn)定的主鏈構(gòu)象在抑制冰晶生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作。Huang等人從冬季歐白英中克隆得到了一種熱滯蛋白基因STHP64,并得到了全長(zhǎng)的熱滯蛋白STHP6。該蛋白WRKY蛋白極為相,WRKY蛋白是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)病原菌相關(guān)蛋白pathogenreatedpoten)翻譯的重要因子,由此推,AFPs和抗病蛋白可能存在著某種聯(lián)Kmbe通過(guò)對(duì)黑麥草EST文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)了5條編碼具有重結(jié)晶抑制活性蛋白的基因,并將其定義為冰活性蛋白CPs(ceactvespotens)基因,每個(gè)編碼蛋N端都富含親水性氨基酸且存在著信號(hào)肽,其中的4條有與植物蛋白激酶受體相似的亮氨酸富集,其C端則存在著XNVXG的重復(fù)結(jié)構(gòu),這一結(jié)構(gòu)參與形成了CPs高級(jí)結(jié)構(gòu)的冰晶結(jié)合位點(diǎn)的2卷曲9。Smen等人10從黑麥小大麥中鑒定了15條冰重結(jié)晶抑制蛋白R(shí)I基因并進(jìn)行了分子遺傳發(fā)育分析,結(jié)果發(fā),其RI家族基因大約發(fā)生在36百萬(wàn)年;黑麥草與胡蘿卜的編碼基因均不含內(nèi)含,且均與擬南芥的LRR轉(zhuǎn)膜蛋白激酶同,其研究結(jié)果還表,RI蛋白由RI結(jié)構(gòu)域復(fù)制增加進(jìn)化而,但兩者分別采取了不同的分子進(jìn)化機(jī)。上述各項(xiàng)研究結(jié)果都表,植物抗凍蛋白與抗菌蛋白具有相似的生化結(jié),也就是說(shuō),植物的抗凍和抗病反應(yīng)有著共同或類似的反應(yīng)體。這些低溫誘導(dǎo)病原的相關(guān)蛋白可能起著改變植物體液的結(jié)冰特性或冰晶結(jié)合位點(diǎn)的作用,在低溫和受到病原入侵時(shí),植物的細(xì)胞壁都會(huì)發(fā)生一些生理變化以避免細(xì)胞內(nèi)環(huán)境受到破。.3植物抗凍蛋白的作用機(jī)制一般情況下,相對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)而言,緩慢生長(zhǎng)的冰晶能把蛋白質(zhì)從冰的前面推開(kāi),從而阻止蛋白質(zhì)與冰相結(jié),這導(dǎo)致與冰結(jié)合的蛋白質(zhì)的含量低于溶液中的10%,而AFPs與之相反,其中的89%結(jié)合于冰。AFPs與冰之間的相互作用非常穩(wěn)Ramond吸附—抑制模型理論11認(rèn)為,AFPs通過(guò)自身吸附到冰晶表面從而抑制冰晶的生,而不是通過(guò)把水與冰隔離開(kāi)來(lái)才使得水不再結(jié)冰;在這一理論基礎(chǔ)上,1983年,DVies提出晶格匹配模型,該模型也被稱氫鍵匹配模;1988年,Yang等人提出偶極子—偶極子模;1993年,Knght等人12提出品格占有模4個(gè)模型雖然側(cè)重點(diǎn)各不相同,但是它們有著一個(gè)共同之,AFPs與冰晶之間通過(guò)氫鍵進(jìn)行結(jié),只是氫鍵的數(shù)量幣¨形成的方式不同而。因,將此4個(gè)模型歸氫鍵結(jié)合模型這一大類13。目前,解釋抗凍蛋白機(jī)理較好的理論表面互補(bǔ)模型理論14,其核心內(nèi)容AFPs的冰晶結(jié)合位點(diǎn)所形成的表面能與冰晶的表面形成互該模型理論認(rèn)為,AFPs與冰晶之間所形成的表面互補(bǔ)與多種相互作用力有關(guān),主要是疏水作用和范德華力,氫鍵起著次要的作。較強(qiáng)的表面作用力使得AFPs與冰晶結(jié)合是不可逆的,這種不可逆性阻止了冰晶的生。該模型還成功地解釋了,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有極大差異性的AFPs能與不同形狀的冰晶表面結(jié)合,另一個(gè)原因是冰晶含有許多個(gè)不同的表,每個(gè)表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和氧原子間距都不相同,AFPs在與任何一個(gè)冰晶表面結(jié)合后都將阻止冰晶的生。冰晶就像配體一樣,通過(guò)表面互補(bǔ)選擇性地與不同受體AFPs結(jié)合,這種表面互補(bǔ)方式可適用于所有AFP。不同植物AFPs的DNA和氨基酸序列之間幾乎沒(méi)有同源性15,但它們擁有相似的高級(jí)結(jié),冰晶結(jié)合位點(diǎn)也有一定的相似。當(dāng)前研究較多的黑麥草抗凍蛋白LAFP,其理論上的三維結(jié)構(gòu)為一個(gè)由個(gè)圓環(huán)組成的非常有規(guī)律的右手Β螺旋,螺旋上的每個(gè)圓環(huán)含有1～15個(gè)氨基酸殘,由此形成了兩個(gè)保守的重復(fù)單元XNVXG,推測(cè)這個(gè)重復(fù)單元包含有LAFP的冰晶結(jié)合位,但還沒(méi)有確定的具體氨基。在重復(fù)單元XNVXG,NVVG之間主要Thr殘基,TVT殘基簇,這與黃粉蟲(chóng)和云AFP的冰晶結(jié)合位TXT十分相似,很有可能LAFP的冰晶結(jié)合位點(diǎn),LAFP的冰晶結(jié)合表面可以和冰晶棱面形成緊密的表面互。從中國(guó)胡蘿卜栽培品種中克隆的DAFP的理論三維結(jié)構(gòu)為一個(gè)非常有規(guī)律的右手Β螺旋,螺旋的每個(gè)Β環(huán)LRR基序的24個(gè)氨基酸殘基組,其結(jié)構(gòu)特征主要為由保守L(包括)組成的疏水核心和保守的P和G組成的Β轉(zhuǎn)角13在24aa基序中的保N的兩側(cè)為親水性很強(qiáng)的氨基酸密集區(qū),形成一個(gè)高度親水性表面,這一表面與冰晶表面剛好形成不完全的互DAFPLRR基序中的高度保守N端對(duì)于維持這個(gè)冰晶結(jié)合表面具有決定性的作。冰核蛋白1974年,L..Maki等人從赤楊樹(shù)的腐爛樹(shù)葉中分離出丁香假單胞菌PseudmAsyngae,他們發(fā)現(xiàn)細(xì)?1994-2013ChinaAcademicJournalElectronicP2冰核蛋。.1 冰核蛋白的結(jié)構(gòu)特性根菌(cen冰核蛋。.1 冰核蛋白的結(jié)構(gòu)特性根菌(cenuceatonactve),分為三:I白A或Tpe),-～-2℃;II白B或TpeI),-～-5℃;l白C或TpeII),-1～-7℃。細(xì)菌冰核蛋白NPs由冰核基因(na基因)單獨(dú)編陸續(xù)克隆得到的na基因有nanaWnana、naAnanaUnaV等基,這些基因都是一些從3600p到4000p左右的開(kāi)放讀碼框16?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果表明,冰核蛋白基因序列同源性為77%17冰核細(xì)菌的冰核活性蛋白具有相似的一級(jí)結(jié),由三個(gè)完全獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組:N端單一序列結(jié)構(gòu),占整個(gè)序列的15%,該結(jié)構(gòu)是相對(duì)疏水;C端單一序列結(jié)構(gòu),占整個(gè)序列的4%,因富含酸性和堿性氨基酸殘基而高度親;中間重復(fù)序列R結(jié)構(gòu),占81%,由冰核基因中間部分的相對(duì)保守的不完整的24p周期性重復(fù)的DNA序列CCGGTTATGAACTACC編碼成相對(duì)應(yīng)的重復(fù)的八肽AlaGyTyrGySerThrLeuThr18,再由八肽序列構(gòu)成高度重復(fù)的四十八,四十八肽中特別富AlGyThr和Se。冰核蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由氫鍵連接而形成的片層結(jié),其重復(fù)的單位具有親水性,因此具有顯著的親水。冰核活性細(xì)菌正是以這種重復(fù)序列作為結(jié)晶模板,將水分子排列成細(xì)膩的冰核,含有冰核細(xì)菌的植物在-～-5℃的條件下可使植物細(xì)胞水結(jié)。中心重復(fù)區(qū)域在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出高保真,是冰核活性的重要模。陳慶森等人19采用差速離心法分離出有活性的冰核活性蛋白組,DS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表,冰核活性蛋白是由一種高保真的48肽的單體形式裝配而成的多聚。這結(jié)果Watabe和Arail所得結(jié)論是一致的,表現(xiàn)冰核活性的最小結(jié)構(gòu)單位是240肽,分子量約為26D。Green等人對(duì)來(lái)自于.yrngaeS203的naZ冰核基因進(jìn)行重排后發(fā),冰核基因中間重復(fù)區(qū)的肽段對(duì)冰核形成作用是獨(dú)立,對(duì)冰核活性的表達(dá)起著重要作WatanabeK的研究結(jié)果18證實(shí)了冰核蛋白基因中間重復(fù)序R結(jié)構(gòu)域是表現(xiàn)冰核蛋白活性差異的主要片Keko等人對(duì)冰核活性基因N結(jié)構(gòu)域進(jìn)行缺失研究后發(fā),N結(jié)構(gòu)域與NP的活性相關(guān),控制I型NP的活,但對(duì)IIl型的NP產(chǎn)生了影響,這也驗(yàn)證了R結(jié)構(gòu)域是NP的活性作用位1995年,Mchgm20用wnauedvoa的nU作突變分析,結(jié)果發(fā),C2末端12個(gè)氨基酸殘基并不是必需的,但是,如把包Met29在內(nèi)C末端13個(gè)氨基酸全部剔,將會(huì)導(dǎo)致冰核活性幾乎完全喪失,且逐步缺C端序列會(huì)造成各種類型冰核的完全喪對(duì)NP基因的分析結(jié)果表,冰核活性基因具有高度的同源,中間重復(fù)區(qū)域是冰核蛋白的活性位點(diǎn),基因的完整性是保障冰核活性的前提,是表達(dá)I型冰核活性蛋白的基。Turner和Kozloff于1991年研究發(fā)現(xiàn),冰核蛋白在本質(zhì)上是冰核蛋白復(fù)合物,且冰核蛋白是通過(guò)PI而錨定于細(xì)胞膜上。冰核細(xì)菌表達(dá)的強(qiáng)冰核活性物質(zhì)僅僅依靠細(xì)菌的冰核蛋白成分是不夠,磷脂酰肌磷脂冰核蛋白復(fù)合物的主要成,而且是必要成。Kozoffwestway等人研究發(fā)現(xiàn),aseudmnas和Ewna兩種冰核細(xì)菌具有磷脂酰肌醇合成酶活TurnerArelao采用二種對(duì)PIphophatdylosio,磷脂酰肌醇)具有不同水解活性的酶對(duì)生物活性冰核進(jìn)行處理,高度純化的磷酸脂酶CIIA型冰核活性的選擇性破壞及冰核蛋白在脫離細(xì)胞膜之后冰核活性的大大降低,證明了PI參與了A型冰核結(jié)構(gòu)的形,而且證明了冰核蛋白是一種PI錨定蛋;磷脂?；己土字€增強(qiáng)了細(xì)胞膜的強(qiáng)度,避免了在細(xì)胞脫水收縮或再次吸水膨脹時(shí)細(xì)胞膜的破。.2冰核蛋白的作用機(jī)制目前關(guān)于冰核蛋白是如何結(jié)合到細(xì)胞膜相應(yīng)位點(diǎn)上,并如何聚合成冰核蛋白復(fù)合物及如何表現(xiàn)出冰核活性等問(wèn)題仍在進(jìn)一步的探索之N的定位有。端單一序列結(jié)構(gòu)域含有幾個(gè)較疏水片,可能與冰核蛋白在細(xì)胞外膜上3抗凍蛋白與冰核蛋白的協(xié)作機(jī)制植物要抵抗冰凍的危害,需要具備兩個(gè)最基本的要:一是避免細(xì)胞內(nèi)結(jié);二是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及核酸蛋白質(zhì)等生命物質(zhì)應(yīng)具有低溫穩(wěn)定大量研究結(jié)果表明,細(xì)胞外結(jié)冰和細(xì)胞液的過(guò)冷卻是植物避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰傷第2期樊紹剛:抗凍蛋白和冰核蛋白對(duì)植物抗凍性能的作用機(jī)制12第2期樊紹剛:抗凍蛋白和冰核蛋白對(duì)植物抗凍性能的作用機(jī)制129害的最主要和最普遍的兩種適應(yīng)機(jī)制21。植物體內(nèi)含有大量的水分,尤其在幼枝嫩芽等組分中水分含量較,而水的過(guò)冷卻特性使得機(jī)體有過(guò)冷卻的特但與昆蟲(chóng)和魚(yú)類不同,植物體直接暴露在低溫空氣,生存環(huán)境不能保溫,因此面對(duì)的低溫環(huán)境更為嚴(yán)植物體內(nèi)水相體積較大,沒(méi)有魚(yú)和昆蟲(chóng)的腔室結(jié)構(gòu),過(guò)冷卻能力較。由于可能同時(shí)受到植物生理脅機(jī)械傷害和環(huán)境生物危害等因素的影,植物凍害仍成為困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大問(wèn)。長(zhǎng)期以,抗凍蛋白和冰核蛋白的研究和應(yīng)用都只局限于促進(jìn)結(jié)冰或抗凍特性單一方,而抗凍蛋白在器官移低溫保藏等領(lǐng)域的研究取得了很大的成。利用抗凍蛋白的多樣性,可適當(dāng)?shù)貙⒖箖龅鞍讘?yīng)用于生物樣品的低溫凍存之,如富含甘氨酸的雪蚤抗凍蛋白可較大幅度地降低冰點(diǎn)溫度(6℃左右),且在較高溫度條件下抗凍蛋白分解并失去其結(jié)構(gòu),從而減少有害抗體形成的可能;還能顯著提高細(xì)胞的存活,甚至使原先不能存活的樣品凍存成功,從而延長(zhǎng)人體器官的體外壽,以便于運(yùn)在實(shí)際使用時(shí)濃度不宜太高,濃度過(guò)高時(shí),雖然能阻止溶液重冰晶,但膜表面卻會(huì)生成大量的冰。冰核蛋白則應(yīng)用于促凍殺人工降食品冷凍濃人工調(diào)節(jié)天細(xì)菌細(xì)胞表面展報(bào)告基因等領(lǐng)。根據(jù)兩者的特性,從生物化學(xué)和生物動(dòng)力學(xué)的角度研究其在低溫環(huán)境下的相互關(guān),是探究生物抗凍機(jī)理的新思,能為農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上的防寒防凍和基因改良提供指。.1冰核蛋白與抗凍蛋白的拮抗作用對(duì)于不能忍受冰害的植物,首先要除去其冰核蛋白的生物活。細(xì)菌的冰核蛋,通常是經(jīng)由細(xì)菌的入侵傷害而引發(fā)植物凍害的發(fā)生的,而抗凍蛋白同時(shí)具備了抗病抗逆的雙重功能,迄今為,研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多的植物體內(nèi)不同抗凍蛋白的各種抗病,如植物凝集WRKY蛋脫水素研究中還發(fā),外界因素如重金屬離硫制脲巰基試2G蛋白植物外源凝集素等化學(xué)試劑和紫外鈷的照射等物理作用均可對(duì)冰核細(xì)菌的冰核活性產(chǎn)生一定的影這使得我們相信,生物體內(nèi)有可能存在抑制冰核細(xì)菌及冰核蛋白活性的基因及編碼蛋白(如抗菌素等)我們也可以尋找生物體內(nèi)抑制冰核蛋白活性的物質(zhì),如為避免結(jié)冰昆蟲(chóng)體內(nèi)也含有NPs,通過(guò)封閉其冰核活性從而阻止冰晶的生深入研究昆蟲(chóng)的生理變化情,有助于冰核蛋白抑制劑的發(fā)利用基因工程手,在抗凍蛋白序列中插入抗菌素編碼序列或編碼磷脂酞肌醇酶和磷脂酶的基合成磷脂酞肌醇酶,從而破壞冰核蛋白復(fù)合物的結(jié),都可作為植物抗凍基因工程的策。.2冰核蛋白與抗凍蛋白的協(xié)同作用昆蟲(chóng)忍耐結(jié)冰的生理機(jī)制為植物抗凍研究提供了新的思在忍耐結(jié)冰昆蟲(chóng)的血淋巴中存在NP,可以誘導(dǎo)胞外在較高的亞低溫(-10℃)條件下結(jié)冰,使細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外溶液與細(xì)胞外冰晶水蒸氣氣壓緩慢達(dá)到平衡,降低了細(xì)胞內(nèi)冰點(diǎn)和過(guò)冷卻,同時(shí),細(xì)胞膜阻擋冰晶過(guò)膜,降低細(xì)胞內(nèi)及各個(gè)細(xì)胞器結(jié)冰的可能性22。這種結(jié)冰機(jī)制只是發(fā)生在細(xì)胞外的血液循環(huán)系統(tǒng)和組織周圍的體液,而不會(huì)發(fā)生在細(xì)胞這樣能有效防止像避免結(jié)冰昆蟲(chóng)體內(nèi)的單一由抗凍蛋白作用降低過(guò)冷卻點(diǎn)而在遭遇氣溫突變時(shí)導(dǎo)致的致死性的發(fā)。因?yàn)楫?dāng)溫度低于過(guò)冷卻點(diǎn),誘發(fā)低溫下細(xì)胞外結(jié)冰,使細(xì)胞周圍的血淋巴所含溶質(zhì)排除在冰晶外,增加細(xì)胞外溶液的滲透壓,引起細(xì)胞內(nèi)的水分向細(xì)胞外流動(dòng),細(xì)胞縮水且胞外冰晶增,造成對(duì)蟲(chóng)體的傷害22。對(duì)于耐受結(jié)冰植物來(lái)說(shuō),抗凍蛋白和冰核蛋白通過(guò)抑制細(xì)胞外冰晶重結(jié)晶和控制冰晶形態(tài),同時(shí)相當(dāng)于形成一層屏,阻止增長(zhǎng)的冰晶侵入葉表皮和細(xì)胞內(nèi),避免了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形Phakaki等人認(rèn),抗凍植物形成了一種特殊的控制胞外冰晶形成的機(jī),即抗凍蛋白和冰核形成誘導(dǎo)物質(zhì)的協(xié)同作前者降低冰,減緩冰晶形成的速;后者促進(jìn)冰晶的形。在冰凍溫度,通過(guò)兩種物質(zhì)的協(xié)同作用調(diào)控胞外水結(jié)冰的速度和冰晶的形態(tài),從而減緩或避免因結(jié)冰而造成的對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷及滲透脅迫23。有些高山植物也能產(chǎn)生冰核,使胞間水在冰點(diǎn)附近發(fā)生結(jié),把胞內(nèi)水吸到細(xì)胞間以防止胞內(nèi)結(jié)冰,冰核蛋白復(fù)合物中的磷脂酰基醇和磷脂加強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作,防止了收縮膨大時(shí)膜的破。對(duì)于不能忍受胞內(nèi)結(jié)冰的植物,施加生物冰,應(yīng)該能夠減輕凍害的程度24。這就為低熱滯活性植物抗凍蛋白和強(qiáng)冰核活性冰核蛋白的配合使用提供了理論依。可以把細(xì)菌的冰核基因?qū)胫?冰核序列具有高保真性,它有效表達(dá)后會(huì)產(chǎn)生生物冰核,這樣能大大提高胞間水發(fā)生結(jié)冰的溫度,增強(qiáng)抗寒。冰核蛋白和抗凍蛋白都結(jié)合在細(xì)胞表面,抗凍蛋白結(jié)合到細(xì)胞表面后大部分與水分子結(jié)合,高度重疊的冰核蛋白氨基酸序列則為冰核的形成提供了一種必要的晶格序。常規(guī)的冷凍結(jié)構(gòu)是冰晶無(wú)序形成和全向生長(zhǎng),產(chǎn)生海面狀的各向同質(zhì)結(jié)構(gòu),使解凍后的物質(zhì)具有各向同質(zhì)的機(jī)械特。冰核細(xì)菌活性可導(dǎo)致各向非同質(zhì)參考文:1234GrffthM參考文:1234GrffthMAP,YangDS.Antfreeepotenpoduedenogeousynwnterryeeaves[J.PantPhyso,1992,100(2):593-59.LD.Antfreeegyopptdesandpptde:nteractonwtheandwater[J.MetodsEnmo,1986,12:293-30.HonWC,Mynarz.Antfreeepotensnwnterryearesmaropatogenes2reatedpotens[J.PantPhyso,1995,109(3):879-88.GD.Purfatonandharacteratonofathemalhysteresspotenfmapant,thebtterweetnghthade(onmdumara.BohmBophysActa,1994,1206(1):129-13.567魏令,江勇,費(fèi)云.沙冬青葉片熱穩(wěn)定抗凍蛋白特性分析[J.植物學(xué),1999,41(8):837-84.Worral.AarotLeucnrhrpeatpotenthatnhbtserecrystallaton[J.Scen,1998,20:115-11.MhaelWRW,Ron.Purfaton,mmuooaton,cropotectv,andantfreeeactvtyofPA6:Ade2hydrnfmpeah(Prunuspersa)[J.PhysoogaPantarm,1999,10:600-60.ChrsSdeotm,DwnWorral,RodHubbard,eta.Heatstabeantfreeepotenfmgrass[J.nature,2000,40.KmbeK.CharacteratonofafmyofeactvepotensfmtheRyegras,Lolmperenn.Croboog,2008,57(3):263-26.SmenR.Trakngtheeoutonofaodstressasocatedgenefmynodoerantgrase.MCEoutonaryBoogy,2008,(8):24.DavesPL,SykesB.Antfreeepotens[J.CurOpnStructBo,1997,7(6):828-83.鮑麗,華澤釗,任禾.抗凍蛋白及其對(duì)冰晶生長(zhǎng)的影響[J.華東工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,17(2):51-5.王金,張黨.表面互補(bǔ)模型—抗凍