實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定

關(guān)于實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定第一頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆召|(zhì)粒提純的原理和方法;掌握核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒的原理并學(xué)會(huì)運(yùn)用內(nèi)切酶.第二頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一預(yù)習(xí)：基因克隆示意圖第三頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因克隆操作過(guò)程：分分離載體和目的基因切限制酶切載體與目的基因接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體第四頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因載體（genevector）＊什么是基因載體 把一個(gè)有用的目的DNA片段通過(guò)重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的工具＊基因載體的作用 ※為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力 ※為目的基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制（或整 合）和表達(dá) 所需條件第五頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因載體應(yīng)具備特點(diǎn)1.具有獨(dú)立復(fù)制能力，在細(xì)胞中能大量繁殖，從而使目的基因大量擴(kuò)增2.作為表達(dá)載體應(yīng)能利用宿主的酶系統(tǒng)，表達(dá)目的基因（表達(dá)能力）3.具有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別和切割位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)）4.細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高（持續(xù)表達(dá)和復(fù)制）5.具有供篩選用的（遺傳標(biāo)記）6.相對(duì)分子量?。ㄒ欢ǖ娜萘浚?第六頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因載體類型質(zhì)粒(plasmid)粘粒（cosmid）噬菌體(phage)病毒(virus)DNA染色體（BAC/YAC）7第七頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一.質(zhì)粒DNA的制備1關(guān)于質(zhì)粒的概念a.什么是質(zhì)粒（plasmid）？b.質(zhì)粒的本質(zhì)是什么？c.質(zhì)粒有哪些構(gòu)型？c.質(zhì)粒有哪些特點(diǎn)？d.質(zhì)粒的用途有哪些？8第八頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一(1)質(zhì)粒的定義

質(zhì)粒是存在于細(xì)菌體內(nèi)、獨(dú)立于染色體的、可以自主復(fù)制的一類雙鏈環(huán)狀DNA，在細(xì)胞內(nèi)它們常以共價(jià)閉環(huán)的超螺旋(supercoil)形式存在。

9第九頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一①超螺旋DNA(SCDNA)(2)質(zhì)粒的三種構(gòu)型10第十頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一②開(kāi)環(huán)DNA(opencircularDNA,OCDNA)

如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。

11第十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一③線狀DNA(linearDNA,LDNA):

如果兩條鏈均斷開(kāi)，即為線狀DNA。電泳時(shí)，三者泳動(dòng)速度大小關(guān)系（？？？）

12第十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一(3)質(zhì)粒DNA的一般特性：①質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子,有相對(duì)獨(dú)立性。②它能在細(xì)菌中垂直遺傳并賦予宿主細(xì)胞一些表型。③它是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等。13(4)提取質(zhì)粒DNA的目的與意義（？）基因載體/基因克隆/基因工程第十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2提取質(zhì)粒DNA的常規(guī)方法:2.1核酸分離純化的總原則：

保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整排除其他分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機(jī)溶劑、金屬離子、其他DNA、RNA等）第十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.2分離純化質(zhì)粒DNA的主要步驟①培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增（DNA的擴(kuò)增與選擇）②細(xì)菌的收集與裂解收集——高速離心的方法③質(zhì)粒DNA的純化

所有純化方法都是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀的性質(zhì)。第十五頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.SDS-堿裂解法提取質(zhì)粒DNA3.1實(shí)驗(yàn)原理：①在有EDTA及去污劑（SDS）存在的條件下，用堿處理細(xì)菌，可以使細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（染色體DNA、質(zhì)粒DNA、蛋白質(zhì)和RNA等）；處理過(guò)程中，染色體DNA斷裂成不同長(zhǎng)度的雙鏈DNA。16第十六頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一②強(qiáng)堿環(huán)境（pH12.0-12.6）時(shí)：宿主菌的線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質(zhì)粒DNA共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；③當(dāng)加入高濃度酸性鹽，pH值恢復(fù)至中性時(shí)：變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物；而質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，能溶解在上清液中，這樣通過(guò)離心可以把染色體DNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起除去。17第十七頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一④如果要提高DNA的純度，則可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)。18第十八頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.2主要試劑及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl組成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒.(保護(hù)作用)②EDTA

的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用）③Tris?Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）19第十九頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成①SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性（裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）②NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）

20第二十頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一溶液III：HAC和KAC組成的高鹽溶液(復(fù)性作用)①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的堿性，使染色體DNA變性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。②KAC會(huì)與SDS溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。第二十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一

實(shí)

驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)加1.4ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm×30S①除去上清，再取1.4ml離心30s②

除去上清，加入冰的100μl溶液I，顛倒EP管，混勻

加入200μl溶液II，溫和混勻，冰浴3~5min

加入150μl冰溶液III，溫和混勻，冰浴3~5min，12000rpm×5min③

轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚和氯仿/異戊醇(1:1)，12000rpm×5min④轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積氯仿/異戊醇，12000rpm×5min

⑤

上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入2倍體積無(wú)水乙醇，顛倒混勻，-20℃冰箱中放置20min，120005min

⑥

棄上清，沉淀中加1ml70%乙醇，12000rpm×5min

⑦

去上清，管平放室溫靜置10~15min，20μlTE溶解DNA

第二十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一注意事項(xiàng)：

1、加樣槍正確使用；2、標(biāo)記自己所提取的質(zhì)粒類型（pUC119-U6）；3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中；4、加不同溶液要換槍頭；5、離心前把管擦干；6、轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀；7、吸取酚時(shí)槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到皮膚。第二十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒1關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）定義能在特異位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)）上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應(yīng)的限制性DNA片段。主要存在于細(xì)菌體內(nèi)。切割不同來(lái)源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值（“分子手術(shù)刀”）。24第二十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第二十五頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第二十六頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第二十七頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第二十八頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一影響限制酶活性的因素1）“星”活性酶的特異性改變或特異性降低而呈現(xiàn)的活性。

EcoRⅠ：GAATTC

EcoRⅠ*：AATT2）甲基化識(shí)別序列中某些堿基甲基化后會(huì)阻礙酶活性。3）底物性狀4）試劑：緩沖系統(tǒng)第二十九頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一pUC18/19酶切位點(diǎn)的分布示意圖第三十頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2BamHI

、HindⅢ酶切重組質(zhì)粒及鑒定1實(shí)驗(yàn)原理：利用限制性內(nèi)切酶特異的識(shí)別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的DNA片段，通過(guò)電泳對(duì)酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因（重組質(zhì)粒DNA）31第三十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一重組質(zhì)粒BamHIHindIII雙酶切電泳檢測(cè)5'-GAATTC-3‘3'-CTTAAG-5'BamHI5'-AAGCTT-3'3'-TTCGAA-5'

HindIII第三十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2實(shí)驗(yàn)材料:

重組質(zhì)粒;BamHI

、HindⅢ限制性內(nèi)切酶;反應(yīng)緩沖液;瓊脂糖凝膠電泳所需試劑和設(shè)備。33第三十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3實(shí)驗(yàn)步驟:A建立反應(yīng)體系B酶切反應(yīng)（溫育1-3h）C電泳鑒定34第三十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4、雙酶切體系（0.2mlEP管）：質(zhì)粒DNA10μl10×Mbuffer2μl

BamHⅠ1μlHindⅢ1μl