大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

關(guān)于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞第一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笸ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術(shù)。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。第二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日2.相關(guān)知識(shí)及原理感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells):受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。

第三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日轉(zhuǎn)化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。第四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日轉(zhuǎn)化的方法：化學(xué)的方法(熱擊法)；使用化學(xué)試劑（如CaCl）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。第五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日克隆的篩選：主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；第六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。否則，如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會(huì)出現(xiàn)成千上萬的細(xì)菌菌落，將難以確認(rèn)哪一個(gè)克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。雖然只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌才能在含有抗生素的平板上生長和繁殖，但對于連接混合物而言，此時(shí)并不能確定哪個(gè)克隆含有插入片段。第七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日重組質(zhì)?？寺〉蔫b定鑒定帶有重組質(zhì)?？寺〉姆椒ǔＳ玫挠?互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。最常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析，對于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合-互補(bǔ)現(xiàn)象來篩選。第八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日-互補(bǔ)現(xiàn)象：因?yàn)橛行┹d體都帶有一個(gè)LacZ基因的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息，編碼-互補(bǔ)肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（-互補(bǔ)）。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞中時(shí)，在異丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，宿主可同時(shí)合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱這種現(xiàn)象為-互補(bǔ)現(xiàn)象。第九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日由互補(bǔ)產(chǎn)生的－半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－半乳糖苷(X-gal)而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所以利用這個(gè)特點(diǎn)，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個(gè)多克隆位點(diǎn)，當(dāng)插入一個(gè)外源DNA片段時(shí)，會(huì)造成LacZ()基因的失活，破壞-互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。第十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日第十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌過程示意圖第十二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日3．儀器、材料和試劑無菌超凈臺(tái)，電熱恒溫水浴，分光光度計(jì)，離心機(jī)，移液器，微型離心管等；菌株：E.coliDH5α質(zhì)粒：pBluscriptKS+DNA

片段的重組質(zhì)粒以及pBluscriptKS

空質(zhì)粒；LB培養(yǎng)基；含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉素，濃度50-100μg／mL，X-gal20-48μg/ml,IPTG100μg/ml。一般將抗生素、X-gal和IPTG配制成1000儲(chǔ)備液，用時(shí)按培養(yǎng)基的量再加入）；預(yù)冷CaCl2溶液（0.1mol／L）第十三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日4．操作步驟

1）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)（1）從新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期。將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時(shí)停止培養(yǎng)；第十四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日（2）每組取培養(yǎng)液3個(gè)2ml轉(zhuǎn)入2ml離心管中，在冰上冷卻20-30min，于4℃，4000r／min離心10min（從這一步開始，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）；（3）倒凈上清培養(yǎng)液，用1ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴；（4）0～4℃，4000r／min離心10min；（5）棄去上清液，加入500μl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞。0～4℃，4000r／min離心10min；第十五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日（6）棄去上清液，加入100μl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；（7）制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。第十六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日2）細(xì)胞轉(zhuǎn)化

(1)分別取3個(gè)100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作)，第一組，加入10μl重組質(zhì)粒DNA(體積不超過10μl)+100μl感受態(tài)細(xì)胞，此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組。第二組，插入DNA片段對照組，即酶切后DNA片段25ng+100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液；第三組，質(zhì)粒DNA對照組，即1ng未酶切pBluescript質(zhì)粒DNA十100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液。第十七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日(2)將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保溫1－2min，然后迅速冰上冷卻2min(3)立即向上述管中分別加入0.4mlLB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min，使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)。第十八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日3)平板培養(yǎng)（有時(shí)需要稀釋）取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂勻（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）。第十九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日(2)菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12-16小時(shí))，待菌落生長良好而又未互相重疊時(shí)停止培養(yǎng)，對于可以藍(lán)白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來說，此時(shí)應(yīng)該能清楚地看到藍(lán)色和白色菌落。用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5106-2107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落。在實(shí)際工作中，每微克有105以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一般的克隆實(shí)驗(yàn)。第二十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日4)檢出轉(zhuǎn)化體和計(jì)算轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長狀況應(yīng)如表所示:

第二十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期日組含抗菌素的平板結(jié)果說明

轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組白色