生物工藝設(shè)計原理課程設(shè)計報告

-.z課程設(shè)計報告課程名稱：生物工藝原理題目：假絲酵母恒化培養(yǎng)生物反響器設(shè)計學(xué)院：生命科學(xué)與食品工程學(xué)院專業(yè)班級：生物工程101班學(xué)號：5602210032學(xué)生**：辛鑫指導(dǎo)教師：段學(xué)輝2012年12月24日目錄一、任務(wù)要求41.1設(shè)計目的41.2設(shè)計任務(wù)41.3設(shè)計要求4二、設(shè)計原理52.1恒化培養(yǎng)生物反響器的概念及原理52.2恒化培養(yǎng)的優(yōu)越性52.3恒化培養(yǎng)反響器的應(yīng)用5三、具體設(shè)計63.1根本要求63.3設(shè)備組成73.4具體操作73.5主要工藝參數(shù)9四、總結(jié)104.1設(shè)備總結(jié)104.2心得體會10五、參考資料11一、任務(wù)要求1.1設(shè)計目的假絲酵母(Candida)細(xì)胞圓形、卵形或長形。多邊出芽繁殖。能形成假菌絲。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落為乳白色，平滑，有光澤，邊緣整齊或菌絲狀。液體培養(yǎng)的能形成浮膜。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖。不能發(fā)酵麥芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖。不分解脂肪。能同化硝酸鹽。假絲酵母的蛋白質(zhì)和維生素B含量都比啤酒酵母高。它能以尿素和硝酸鹽作氮源，在培養(yǎng)基中不加其它因子即可生長。它能利用造紙工業(yè)中的亞硫酸廢液，也能利用糖蜜、馬鈴薯淀粉和木材水解液等。因此能利用假絲酵母來處理工業(yè)和農(nóng)副產(chǎn)品加工業(yè)的廢棄物，生產(chǎn)可食用的蛋白質(zhì)，在綜合利用中很有價值。此屬中有的菌能轉(zhuǎn)化50％的糖成為甘油。假絲酵母也是脂肪酶的生產(chǎn)菌種，在工業(yè)上可用于絹紡原料的脫脂單細(xì)胞蛋白〔SCP〕是從酵母或細(xì)菌等微生物菌體中獲取的蛋白質(zhì)。微生物細(xì)胞中含有豐富的蛋白質(zhì)，例如酵母菌蛋白質(zhì)含量占細(xì)胞干物質(zhì)的45%～55%；細(xì)菌蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的60%～80%；霉菌絲體蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的30%～50%；單細(xì)胞藻類如小球藻等蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的55%～60%，而作物中含蛋白質(zhì)最高的是大豆，其蛋白質(zhì)含量也不過是35%～40%。單細(xì)胞蛋白的氨基酸組成不亞于動物蛋白質(zhì)，如酵母菌體蛋白，其營養(yǎng)十分豐富，人體必需的8種氨基酸，除蛋氨酸外，它具備7種，故有“人造肉〞之稱。一般成人每天吃干酵母10～15g，蛋白質(zhì)的需要量就足夠了。微生物細(xì)胞中除含有蛋白質(zhì)外，還含有豐富的碳水化合物以及脂類、維生素、礦物質(zhì)，因此單細(xì)胞蛋白營養(yǎng)價值很高。1.2設(shè)計任務(wù)自主設(shè)計一個假絲酵母恒化培養(yǎng)生物反響器。根據(jù)實(shí)際情況和經(jīng)濟(jì)方面的考慮，最終選擇了假絲酵母作為我們生產(chǎn)菌種，玉米淀粉渣作為菌種發(fā)酵所用的材料。1.3設(shè)計要求自主設(shè)計，說明恒化器的加料系統(tǒng)，放料系統(tǒng)，發(fā)酵罐體積等。在設(shè)計中了解連續(xù)培養(yǎng)在實(shí)際生產(chǎn)中的重要性，發(fā)現(xiàn)恒化器培養(yǎng)的優(yōu)越性，并理解恒化器的概念，掌握恒化器的工作原理。通過設(shè)計恒化培養(yǎng)生物反響器了解培養(yǎng)過程中微生物的生長繁殖過程，利用實(shí)驗(yàn)中學(xué)到的知識，培養(yǎng)理論與實(shí)際結(jié)合的能力。二、設(shè)計原理2.1恒化培養(yǎng)生物反響器的概念及原理生物反響器是利用酶或生物體〔如微生物〕所具有的生物功能，在體外進(jìn)展生化反響的裝置系統(tǒng)，它是一種生物功能模擬機(jī)，如發(fā)酵罐、固定化酶或固定化細(xì)胞反響器等。在酒類、醫(yī)藥生產(chǎn)、有機(jī)污染物降解方面有重要應(yīng)用。恒化培養(yǎng)反響器通過控制*一營養(yǎng)物濃度〔如碳源、氮源、生長因子等〕，使其始終成為生長限制因子，而到達(dá)控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進(jìn)展連續(xù)生長繁殖。當(dāng)多種微生物在同一反響器中混合連續(xù)培養(yǎng)時，各種微生物競爭利用限制性基質(zhì)，從而具有優(yōu)勢的微生物得以保存不具優(yōu)勢的微生物則被淘汰。當(dāng)*一種微生物在連續(xù)培養(yǎng)是發(fā)生變異，則原出發(fā)菌與變異菌之間發(fā)生競爭。2.2恒化培養(yǎng)的優(yōu)越性分批培養(yǎng)所培養(yǎng)的細(xì)胞，通常是經(jīng)過停頓期、對數(shù)期、靜止期的生長過程。在培養(yǎng)過程中，常有因培養(yǎng)基成分、細(xì)胞密度等發(fā)生變化，使細(xì)胞環(huán)境不能保持一定的欠缺，但所使用裝置和方法均較連續(xù)培養(yǎng)法簡便，所以被廣泛使用。恒化器培養(yǎng)微生物不經(jīng)過“四個階段〞，菌群根本是在對數(shù)生長期旺盛生長，產(chǎn)量很大。大局部培育菌體根本使用發(fā)酵罐分級發(fā)酵，從種子罐到生產(chǎn)罐，逐級擴(kuò)大，這種方法存在占用設(shè)備量大，每一級都要經(jīng)過接種、培養(yǎng)和放罐的過程，操作復(fù)雜，易感染雜菌、老化菌多，變異性達(dá)等問題，這個設(shè)備能夠連續(xù)培養(yǎng)微生物，且設(shè)備占用少，操作不復(fù)雜。2.3恒化培養(yǎng)反響器的應(yīng)用微生物的連續(xù)培養(yǎng)是相對于分批培養(yǎng)而言的。連續(xù)培養(yǎng)是指在深入研究分批培養(yǎng)中生長曲線形成的內(nèi)在機(jī)制的根底上，開放培養(yǎng)系統(tǒng)，不斷補(bǔ)充營養(yǎng)液、解除抑制因子、優(yōu)化生長代謝環(huán)境的培養(yǎng)方式。由于培養(yǎng)系統(tǒng)的相對開放性，因此，連續(xù)培養(yǎng)也稱為開放培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)的顯著特點(diǎn)與優(yōu)勢是，它可以根據(jù)研究者的目的，在一定程度上，人為控制典型生長曲線中的*個時期，使之縮短或延長時間，使*個時期的細(xì)胞加速或降低代謝速率，從而大大提高培養(yǎng)過程的人為可控性和效率。連續(xù)培養(yǎng)模式應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)則稱之為連續(xù)發(fā)酵。恒化連續(xù)培養(yǎng)往往控制微生物在低于最高生長速率的條件下生長繁殖。恒化連續(xù)培養(yǎng)在研究微生物利用*種底物進(jìn)展代謝的規(guī)律方面被廣泛采用。因此，它是微生物營養(yǎng)、生長、繁殖、代謝和基表達(dá)與調(diào)控等根底與應(yīng)用根底研究的重要技術(shù)手段。三、具體設(shè)計這次設(shè)計通過結(jié)合以前學(xué)過的發(fā)酵，連續(xù)培養(yǎng)，恒化器，培養(yǎng)基的配置原則等理論知識，結(jié)合生物實(shí)驗(yàn)中學(xué)到的操作等，參考一定的書籍以及查詢網(wǎng)絡(luò)設(shè)計出來的。3.1根本要求〔1〕保證系統(tǒng)內(nèi)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)物不受污染；〔2〕新的培養(yǎng)基以可調(diào)控的速度逐滴參加培養(yǎng)罐，同時有相應(yīng)數(shù)量的老培養(yǎng)液排出，保持培養(yǎng)物總量恒定；〔3〕培養(yǎng)罐內(nèi)培養(yǎng)物應(yīng)充分?jǐn)嚢?，保持均一，使流入的新培養(yǎng)基在瞬間即可均勻的分布到整個培養(yǎng)物中；〔4〕以*一營養(yǎng)成分為生長限制底物的液體培養(yǎng)基；〔5〕根據(jù)需要對溫度、通氣程度、培養(yǎng)物PH的監(jiān)測和調(diào)節(jié)設(shè)相應(yīng)的附加裝置。3.2設(shè)備圖3.3設(shè)備組成〔1〕主體構(gòu)造：發(fā)酵罐主要由內(nèi)外兩層罐體構(gòu)成。其中，外筒工作時參加水，下接有加熱管和熱電偶，可以把水加熱并保持到預(yù)期的溫度；內(nèi)筒工作時從上參加培養(yǎng)基和菌種。利用內(nèi)層筒體進(jìn)展傳熱雖然會降低熱效率，但這樣既可以防止培養(yǎng)基因到達(dá)沸點(diǎn)而沸騰起來，又可防止加熱管直接加熱到菌絲而造成菌體死亡?！?〕補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)料儲液罐，蠕動泵〔3〕出料及取樣系統(tǒng)：封口堿液罐，廢液池，止動閥，玻璃三通〔4〕酸堿調(diào)控系統(tǒng)：酸堿儲液罐，PH調(diào)控裝置，玻璃三通〔5〕進(jìn)氣導(dǎo)入管，橡皮塞，導(dǎo)管等3.4具體操作A口三通中一個連接口與酸堿PH調(diào)控系統(tǒng)的酸堿儲蓄罐相通，由酸堿PH調(diào)控系統(tǒng)的PH反響蠕動泵和PH調(diào)控裝置在線調(diào)控，另一個連接口與補(bǔ)料系統(tǒng)的補(bǔ)料儲液瓶連接，由補(bǔ)料系統(tǒng)設(shè)置的蠕動泵控制，B孔中的兩個連接口分別與出料及取樣系統(tǒng)設(shè)置的廢棄池和封口堿液罐相通。補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)料系統(tǒng)設(shè)置的蠕動泵與A孔三通中的一個連接口連接，并與補(bǔ)料儲液瓶相通。出料系統(tǒng)：出料及取樣系統(tǒng)包括取樣管，該取樣管連接B孔三通上，前后口由止動閥夾住。培養(yǎng)液A加料至反響池中，然后將培養(yǎng)好的2%-10%接種量的第二代種子液轉(zhuǎn)移到反響池，裝液量100-250L，30-40℃間接發(fā)酵6-10h至對數(shù)期后，開場由補(bǔ)料系統(tǒng)中的蠕動泵以0.01~0.5L/h流加補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基B，同時二氧化碳?xì)怏w以0.1~1.0L裝液量在100~250L之間，氣體經(jīng)進(jìn)氣管至反響液底部能帶動反響液的翻滾，從而減少了額外的攪拌系統(tǒng)，使得整個裝置更加簡單可行。培養(yǎng)液B中限制單一碳源葡萄糖的添加量，使其始終作為生長限制因子，以到達(dá)控制培養(yǎng)液流速保持不變的目的，并使微生物始終在低于其最高生長速率下連續(xù)生長繁殖，補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基B中其他成分都保持過量。連續(xù)培養(yǎng)過程中，每10-15h取樣檢測發(fā)酵液的各項(xiàng)參數(shù)，并每5-14天后無菌取樣，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布到培養(yǎng)基C平板，厭氧培養(yǎng)1-5天，判斷優(yōu)良菌種。其中流加補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基B由反響液體系中生長限制因子的濃度和菌體生物量的變化綜合考慮，不斷調(diào)試稀釋速率的大小，直至反響體系到達(dá)擬穩(wěn)定狀態(tài)，擬穩(wěn)定狀態(tài)定義為：每10-15h取樣檢測發(fā)酵液的各項(xiàng)參數(shù)，連續(xù)三次取樣參數(shù)根本一致時認(rèn)為反響體系到達(dá)擬穩(wěn)定狀態(tài)。為了易于判斷目的突變菌株的出現(xiàn)，生長限制因子并不是讓其被完全消耗掉，而是讓其有所剩余并維持在一個較低的*圍。在擬穩(wěn)定連續(xù)培養(yǎng)中，當(dāng)生長限制因子濃度下降說明菌體生長速率加快，暗示目的突變菌株有可能出現(xiàn)。通過菌株生長速度的快慢，菌落形態(tài)的大小，以及產(chǎn)生變色圈的大小來判斷是否為優(yōu)良菌株，挑取優(yōu)良菌株轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)液B，再培養(yǎng)檢測。監(jiān)測中的取樣，是將取樣管的管口伸入封口堿液罐的液面以下，取樣時夾住出料口管，翻開取樣口管，將反響池整體向取樣口方向傾斜一角度，則有一定發(fā)酵也被氣體壓入取樣管。由此每次取樣都是來自反響池的及時樣液且取樣體積根本一定，取樣口不存在被堵的問題，并解決了需要事先放液的麻煩進(jìn)而保證了反響體積的恒定。長時間的連續(xù)培養(yǎng)需要頻繁的更換補(bǔ)料瓶，常規(guī)方法是在酒精燈火焰上方有效區(qū)域中更換補(bǔ)料瓶，但是這在實(shí)際操作中并不容易且存在很大偶然性，一不小心就會染上雜菌，而此系統(tǒng)是在20%-50%的氫氧化鈉強(qiáng)堿溶液中操縱，染菌幾率大大減少。3.5主要工藝參數(shù)〔1〕培養(yǎng)基A豆粉40g/L,淀粉15g/,豆油5mL/L,K2HPO4g/L,MgsO4·7H2O1g/L,Tween-800.1％,酵母膏5g/L，初始pH值為6.0〔2〕培養(yǎng)基B葡萄糖10g/L,乙酸鈉2.72g/L,NaCL2g/L,CaCL20.4g/L,MgCL20.4g/L,Na2HPO40.62g/L,NaH2PO43.2g/L,K2HPO46g/L,酵母膏，NH4HCO34.8g/L,C4H4O4Na2100，CH3COONa·3H2O80，PH7.0〔3〕其他裝液量100L,二代種子液接種量10%，間歇發(fā)酵10h后，流加補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基、間歇培養(yǎng)基采用培養(yǎng)基A，補(bǔ)料培養(yǎng)基采用培養(yǎng)基B，PH7.0，其中減少有機(jī)氮源酵母膏的含量直至0，同時相應(yīng)提高無機(jī)氮源NH4HCO3濃度至8g/L,充無菌純二氧化碳，流速0.5L/min，溫度30℃①稀釋速率稀釋率在0.01-0.223/h之間按實(shí)際情況調(diào)節(jié)，殘?zhí)菧p少且生物量OD660相應(yīng)增大則提高稀釋率，殘?zhí)窃龆嗲襉D660減少則降低稀釋率，直至到達(dá)擬穩(wěn)態(tài)平衡。平衡判斷標(biāo)準(zhǔn)：每隔15h取樣一次，當(dāng)連續(xù)三次取樣葡萄糖和OD660數(shù)值根本不變時可認(rèn)為到達(dá)擬穩(wěn)態(tài)平衡。當(dāng)培養(yǎng)基B中有機(jī)氮源酵母膏的量減少到0時主要氮源為無機(jī)氮源后，菌株仍生長良好則認(rèn)為生產(chǎn)能夠利用無機(jī)氮源的突變株，每14天無菌取樣稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布培養(yǎng)，從中挑取生長旺盛的接種于B培養(yǎng)基。②發(fā)酵罐體積根據(jù)設(shè)計要求可知：恒化器中的SCP含水量為80%；細(xì)胞的比生長速率μ=0.45；發(fā)酵罐中的一天可生產(chǎn)的SCP濕重＝10kg/(1-0.8)＝50kg故料液的流速F＝50kg/24h＝2.08kg/h在穩(wěn)態(tài)條件下，d*/dt＝0,即u*＝D*由于稀釋率D＝F/V，則u*·V＝F＝2.08kg/h又因?yàn)榧?xì)胞濃度要保持在20—50g/L，取細(xì)胞濃度為30g則Vp·Cc＝2.08/0.45(其中Vp是發(fā)酵液的體積，Cc是細(xì)胞濃度)綜合以上數(shù)據(jù)求得Vp＝154.1L設(shè)定發(fā)酵液只占用發(fā)酵罐的體積的3/4，則發(fā)酵罐的體積為V＝Vp÷0.75＝205.5規(guī)定發(fā)酵罐的體積為V實(shí)際＝200L③生產(chǎn)能力現(xiàn)每天產(chǎn)SCP2t，假絲酵母發(fā)酵周期為54h〔包括發(fā)酵罐清洗、滅菌、進(jìn)出物料等輔助操作時間〕，則每天需糖化液體積為V糖。每天產(chǎn)SCP2t，每噸SCP需糖液31L，則V糖=31L。四、總結(jié)4.1設(shè)備總結(jié)連續(xù)培養(yǎng)延長對數(shù)期是有限的，是相對的。如在發(fā)酵生產(chǎn)中，在細(xì)胞群體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)物開場大量合成時進(jìn)展補(bǔ)料，適當(dāng)增加發(fā)酵液中合成產(chǎn)物的底物量和維持細(xì)胞生存所需要的卑微濃度的營養(yǎng)物，使細(xì)胞在非生長繁殖狀態(tài)下合成產(chǎn)物的持續(xù)時間延長，從而到達(dá)提高單位發(fā)酵液中產(chǎn)物總量〔效價〕之目的。在這種細(xì)胞生長繁殖與目的產(chǎn)物合成處于階段清楚的不同時期工藝技術(shù)，要大幅度地延長目的產(chǎn)物合成期是難以做到的。因?yàn)椋S著對細(xì)胞自身具有一定毒害作用的產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中濃度的提高，其它對細(xì)胞生存不利的代謝產(chǎn)物在環(huán)境中的量也在同時增加，會制約細(xì)胞長時間維持產(chǎn)物合成的高效率。通過補(bǔ)料，適當(dāng)增加營養(yǎng)，可以延緩了細(xì)胞衰老與自溶崩潰，但是，應(yīng)該指出細(xì)胞走向終止代