發(fā)酵-發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵——發(fā)酵培養(yǎng)基第1頁(yè)/共68頁(yè)培養(yǎng)基：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需的一組營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和原料。同時(shí)培養(yǎng)基也為微生物培養(yǎng)提供除營(yíng)養(yǎng)外的其它所必須的條件。

發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：

滿足菌體的生長(zhǎng)促進(jìn)產(chǎn)物的形成第2頁(yè)/共68頁(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的要求①培養(yǎng)基能夠滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟(jì)的合成。②發(fā)酵后所形成的副產(chǎn)物盡可能的少。③培養(yǎng)基的原料應(yīng)因地制宜，價(jià)格低廉；且性能穩(wěn)定，資源豐富，便于采購(gòu)運(yùn)輸，適合大規(guī)模儲(chǔ)藏，能保證生產(chǎn)上的供應(yīng)。④所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足總體工藝的要求，如不應(yīng)該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。第3頁(yè)/共68頁(yè)第一節(jié)培養(yǎng)基的類型及功能培養(yǎng)基按其組成物質(zhì)的純度、狀態(tài)、用途可分為三大類型

一、按純度合成培養(yǎng)基

:原料其化學(xué)成分明確、穩(wěn)定

適合于研究菌種基本代謝和過(guò)程的物質(zhì)變化規(guī)律

培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)單一，價(jià)格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)

天然培養(yǎng)基:采用天然原料

原料來(lái)源豐富(大多為農(nóng)副產(chǎn)品)、價(jià)格低廉、適于工業(yè)化生產(chǎn)

原料質(zhì)量等方面不加控制會(huì)影響生產(chǎn)穩(wěn)定性

第4頁(yè)/共68頁(yè)M培養(yǎng)基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10,pH7.0YPS培養(yǎng)基：酪蛋白胨（日本大五營(yíng)養(yǎng)）10g，酵母提取物（英國(guó)Oxoid）5g,NaCl10g，PH7.2培養(yǎng)大腸桿菌常用兩種培養(yǎng)基第5頁(yè)/共68頁(yè)二、按狀態(tài)固體培養(yǎng)基

:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應(yīng)用于有子實(shí)體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)

半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營(yíng)養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。三、按用途（從發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用考慮）

培養(yǎng)基按其用途可分為孢子（斜面）培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種

第6頁(yè)/共68頁(yè)第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來(lái)源

一、碳源1、作用提供微生物菌種的生長(zhǎng)繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分

提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分2、來(lái)源有機(jī)酸淀粉水解糖、糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等石油、正構(gòu)石蠟、天然氣醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品第7頁(yè)/共68頁(yè)3、工業(yè)上常用的糖類①葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖但是會(huì)引起葡萄糖效應(yīng)

工業(yè)上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達(dá)到一定的質(zhì)量指標(biāo)第8頁(yè)/共68頁(yè)不同的制糖工藝生產(chǎn)的糖液質(zhì)量差別很大第9頁(yè)/共68頁(yè)②糖蜜糖蜜是制糖生產(chǎn)時(shí)的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達(dá)50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。第10頁(yè)/共68頁(yè)不用加工方法對(duì)甘蔗糖蜜的影響第11頁(yè)/共68頁(yè)糖蜜使用的注意點(diǎn)：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進(jìn)行預(yù)處理。1.加酸通風(fēng)沉淀法（冷酸通風(fēng)處理法）

2.加熱加酸沉淀法（熱酸通風(fēng)沉淀法）

3.添加絮凝劑澄清處理法

糖蜜前處理的方法:第12頁(yè)/共68頁(yè)

預(yù)處理法:①活性炭處理法②樹脂處理法③亞硝酸處理法例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶）生物素（發(fā)酵控制）預(yù)處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導(dǎo)致異檸檬酸的生成）預(yù)處理：→黃血鹽第13頁(yè)/共68頁(yè)②淀粉、糊精常用為玉米淀粉、小麥淀粉和甘薯淀粉使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點(diǎn)：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時(shí)加入一定的α-淀粉酶成分比較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源廣泛、價(jià)格底難利用，可以解除葡萄糖效應(yīng)第14頁(yè)/共68頁(yè)淀粉酸解的工藝流程淀粉漿的pH：1.5左右水解壓力：2.5~2.6大氣壓水解時(shí)間：30min一次中和pH：4.8~5.0二次中和pH：6.7~7.0第15頁(yè)/共68頁(yè)酶法糖化的工藝流程液化→糖化→滅酶→過(guò)濾→貯糖計(jì)量→發(fā)酵糖化pH4.2-4.5溫度60C左右糖化酶用量150U/g淀粉第16頁(yè)/共68頁(yè)例：地衣牙孢桿菌生產(chǎn)α-淀粉酶碳源對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響碳源細(xì)胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2第17頁(yè)/共68頁(yè)李江華，無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004(半纖維素酶)(1.5g麩皮)第18頁(yè)/共68頁(yè)嗜堿芽胞桿菌(AC-2)中碳源對(duì)堿性纖維素酶分泌的影響結(jié)果：各種碳源相差不大推論：該菌種的堿性纖維素酶為組成型蘇勤，林業(yè)化學(xué)與工業(yè)，2004第19頁(yè)/共68頁(yè)二、氮源

氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。

1、無(wú)機(jī)氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點(diǎn)：微生物對(duì)它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無(wú)機(jī)氮源的迅速利用常會(huì)引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH第20頁(yè)/共68頁(yè)

無(wú)機(jī)氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無(wú)機(jī)氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無(wú)機(jī)氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對(duì)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程的pH有積極作用。所以選擇合適的無(wú)機(jī)氮源有兩層意義：

滿足菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的pH第21頁(yè)/共68頁(yè)毛霉產(chǎn)蛋白酶的研究陳濤，中國(guó)釀造，2004初始pH的影響:pH偏酸比較好，中性蛋白酶影響大第22頁(yè)/共68頁(yè)無(wú)機(jī)氮源的影響：硫酸銨>硝酸銨>硝酸鈉>尿素第23頁(yè)/共68頁(yè)2、有機(jī)氮源來(lái)源：工業(yè)上常用的有機(jī)氮源都是一些廉價(jià)的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟。成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長(zhǎng)因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等第24頁(yè)/共68頁(yè)

有機(jī)氮源成分復(fù)雜可以從多個(gè)方面對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行影響，而另一方面有機(jī)氮源的來(lái)源具有不穩(wěn)定性。所以在有機(jī)氮源選取時(shí)和使用過(guò)程中，必須考慮原料的波動(dòng)對(duì)發(fā)酵的影響第25頁(yè)/共68頁(yè)氮源使用的一些相關(guān)問(wèn)題：

有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源應(yīng)當(dāng)混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無(wú)機(jī)氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)

有些產(chǎn)物會(huì)受氮源的誘導(dǎo)和阻遏例：蛋白酶的生產(chǎn)

有機(jī)氮源選取時(shí)也要考慮微生物的同化能力

開發(fā)效果好、有針對(duì)性的有機(jī)氮源仍然是令人感興趣的課題第26頁(yè)/共68頁(yè)第27頁(yè)/共68頁(yè)三、無(wú)機(jī)鹽的微量元素包括磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽等礦物鹽鐵、錳、鈷等微量元素功能：構(gòu)成菌體，參與酶的組成，維持酶活性，調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH值，維持氧化還原電位

有些種類的發(fā)酵對(duì)金屬離子相當(dāng)敏感，因?yàn)橛行┙饘匐x子是中間代謝酶的抑制劑或激活劑。如檸檬酸發(fā)酵中鐵、錳和鋅離子能明顯影響產(chǎn)量，鈣離子對(duì)細(xì)菌淀粉酶的生產(chǎn)有促進(jìn)作用，而鈷離子對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的發(fā)酵是必需的金屬離子的影響：第28頁(yè)/共68頁(yè)例：鐵離子青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml

發(fā)酵罐必須進(jìn)行表面處理使用時(shí)注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)α-淀粉酶，P對(duì)酶活的影響

pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘第29頁(yè)/共68頁(yè)四、生長(zhǎng)因子、前體和產(chǎn)物促進(jìn)劑

從廣義上講，凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量的有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長(zhǎng)因子。

1、生長(zhǎng)因子

如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長(zhǎng)因子,生長(zhǎng)因子對(duì)發(fā)酵的調(diào)控起到重要的作用。

有機(jī)氮源是這些生長(zhǎng)因子的重要來(lái)源，多數(shù)有機(jī)氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長(zhǎng)不可缺少的生長(zhǎng)因子第30頁(yè)/共68頁(yè)

前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過(guò)程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。2、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136第31頁(yè)/共68頁(yè)生物合成的前體物質(zhì) 氨基酸菌種前體物質(zhì)產(chǎn)率（%）絲氨酸色氨酸色氨酸蛋氨酸異亮氨酸異亮氨酸蘇氨酸嗜甘油棒狀桿菌異常漢孫酵母麥角菌脫氮極毛桿菌粘質(zhì)賽氏桿菌阿氏棒狀桿菌谷氨酸小球菌甘氨酸氨茴酸吲哚硫代丁酸α-氨基丁酸D-蘇氨酸高絲氨酸1.60.81.31.10.81.52.0第32頁(yè)/共68頁(yè)第33頁(yè)/共68頁(yè)作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份用量：前體的用量可以按分子量衡算，具體使用有個(gè)轉(zhuǎn)化率的問(wèn)題例：6000單位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%實(shí)際使用時(shí)的轉(zhuǎn)化率在46-90%之間例某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素）轉(zhuǎn)化率為：0.6/(0.337*36/13.8)=68%第34頁(yè)/共68頁(yè)用法：前體使用時(shí)普遍采用流加的方法前體一般都有毒性，濃度過(guò)大對(duì)菌體的生長(zhǎng)不利苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%

前體相對(duì)價(jià)格較高，添加過(guò)多，容易引起揮發(fā)和氧化，流加也有利于提高前提的轉(zhuǎn)化率第35頁(yè)/共68頁(yè)3、產(chǎn)物促進(jìn)劑所謂產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。第36頁(yè)/共68頁(yè)發(fā)酵過(guò)程的促進(jìn)劑和抑制劑抗生素被抑制的產(chǎn)物抑制劑鏈霉素去甲基鏈霉素四環(huán)素去甲基金霉素頭孢菌素C利福霉素甘露糖鏈霉素鏈霉素金霉素金霉素頭孢霉素N其他利福霉素甘露聚糖乙硫氨酸溴化物、硫脲硫胺化合物L(fēng)-蛋氨酸巴比妥藥物第37頁(yè)/共68頁(yè)

促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機(jī)制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)，也有人認(rèn)為表面活性劑對(duì)酶的表面失活有保護(hù)作用；有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。第38頁(yè)/共68頁(yè)抑制劑加入后會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，使另一途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種代謝產(chǎn)物，或使正常代謝的某一代謝中間物積累。用于甘油，抗生素工業(yè)第39頁(yè)/共68頁(yè)五、水

對(duì)于發(fā)酵工廠來(lái)說(shuō)，恒定的水源是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诓煌粗写嬖诘母鞣N因素對(duì)微生物發(fā)酵代謝影響甚大。

水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。對(duì)于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻對(duì)于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。第40頁(yè)/共68頁(yè)第三節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和優(yōu)化

目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來(lái)推斷和計(jì)算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗(yàn)配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。

第41頁(yè)/共68頁(yè)一、培養(yǎng)基成分選擇的原則

菌種的同化能力

代謝的阻遏和誘導(dǎo)

合適的C、N比100∶0.2～2.0

pH的要求

第42頁(yè)/共68頁(yè)（一）、理論轉(zhuǎn)化率與實(shí)際轉(zhuǎn)化率

理論轉(zhuǎn)化率是指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進(jìn)行物料衡算，所得出的轉(zhuǎn)化率的大小。

實(shí)際轉(zhuǎn)化率是指實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)化率的大小

如何使實(shí)際轉(zhuǎn)化率接近于理論轉(zhuǎn)化是發(fā)酵控制的一個(gè)目標(biāo)

二、成分含量的確定第43頁(yè)/共68頁(yè)例:

如在酒精生產(chǎn)中葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論轉(zhuǎn)化率計(jì)算如下∶

葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的代謝總反應(yīng)衡算式為∶

C6H12O6─→2C2H5OH+2CO2

葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論得率為∶

2*46

Y=───=0.57162第44頁(yè)/共68頁(yè)第45頁(yè)/共68頁(yè)（二）、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的

合理的實(shí)驗(yàn)方法多因子實(shí)驗(yàn)：均勻設(shè)計(jì)、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析等。多因子實(shí)驗(yàn)第46頁(yè)/共68頁(yè)③當(dāng)培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問(wèn)題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)常采用一些合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。三、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的步驟①根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)基成分確定時(shí)一些必須考慮的問(wèn)題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；第47頁(yè)/共68頁(yè)類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營(yíng)養(yǎng)保健第48頁(yè)/共68頁(yè)原培養(yǎng)基:第49頁(yè)/共68頁(yè)

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)第50頁(yè)/共68頁(yè)

通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進(jìn)一步：乙酸鈉的濃度2%比較好第51頁(yè)/共68頁(yè)結(jié)果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無(wú)機(jī)鹽:復(fù)合無(wú)機(jī)鹽0.05%第52頁(yè)/共68頁(yè)

正交設(shè)計(jì)確定優(yōu)化的配方第53頁(yè)/共68頁(yè)第54頁(yè)/共68頁(yè)第三章發(fā)酵培養(yǎng)基改進(jìn)后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基改進(jìn)后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果第55頁(yè)/共68頁(yè)四、搖瓶水平到反應(yīng)器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應(yīng)器培養(yǎng)基研究的兩個(gè)層次

搖瓶——培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的第一步

反應(yīng)器—最終的優(yōu)化的基礎(chǔ)配方第56頁(yè)/共68頁(yè)例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

輕質(zhì)碳酸鈣1%發(fā)酵罐:葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8%

補(bǔ)加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)差別很大第57頁(yè)/共68頁(yè)搖瓶?jī)?yōu)化配方：菌種篩選，反應(yīng)器研究的基礎(chǔ)第58頁(yè)/共68頁(yè)發(fā)酵罐：反應(yīng)器水平,

可以得出最