標記抗體技術(shù)

關(guān)于標記抗體技術(shù)第一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

抗原與抗體能特異性結(jié)合，但抗體、抗原分子小，在含量低時形成的抗原抗體復合物是不可見的。有一些物質(zhì)即使在超微量時也能通過特殊的方法將其檢測出，如果將這些物質(zhì)標記在抗體分子上，可以通過檢測標記分子來顯示抗原抗體復合物的存在，根據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性和標記分子的敏感性建立的技術(shù)，稱為標記抗體技術(shù)(labeledantibodytechnique)。

第二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

高敏感性的標記分子主要有熒光素、酶、放射性同位素3種，由此建立免疫熒光抗體技術(shù)、免疫酶標記技術(shù)和放射免疫分析。其特異性和敏感性遠遠超過常規(guī)血清學方法，被廣泛應用于病原微生物鑒定、傳染病的診斷、分子生物學中的基因表達產(chǎn)物分析等各個領(lǐng)域。第三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一熒光素和熒光酶

發(fā)光器官主要靠兩種物質(zhì)產(chǎn)生光，一種叫熒光素，另一種叫熒光酶。當熒光素被一定波長的光激發(fā)時就會產(chǎn)生光，而熒光酶則是一種催化劑，它能幫助熒光素與氧結(jié)合產(chǎn)生氧化反應，同時產(chǎn)生光。深海動物發(fā)出的光是一種不發(fā)熱的“冷光”，由于發(fā)光動物含有的熒光素和熒光酶不同，因此發(fā)出的光的顏色也不同，主要有橙、紅、黃、綠、藍、紫、白等顏色，但以藍綠色光居多。

第四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一熒光素和熒光酶

大多數(shù)發(fā)光生物是通過自己身體內(nèi)的熒光素和熒光酶產(chǎn)生光，而少數(shù)發(fā)光生物則是依靠寄生在其發(fā)光器內(nèi)的發(fā)光性細菌發(fā)光，例如有一種閃光魚，在其發(fā)光器內(nèi)寄生著上百億個發(fā)光細菌。有些水母只能通過吃掉其他發(fā)光動物才能發(fā)光。

第五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)

FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。四乙基羅丹明(rhodamine,RB200)RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。

常見的熒光素第六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?/p>

常見的熒光素第七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進行光合作用的自然熒光色素，紅色熒光。酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì):某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。辣根過氧化物酶。藍色常見的熒光素第八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一碘化丙啶（propidiumiodide，PI）：可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對中。紅色熒光

多甲藻葉綠素蛋白

（peridininchlorophyllprotein，PerCP）：PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復合物。深紅色常見的熒光素第九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一生物學、化學和細胞學實驗的特殊試劑：藻藍蛋白還是一種十分稀有的色素蛋白，具有熒光特性，當受光激發(fā)，可發(fā)出強烈的紅色熒光，用于腫瘤和癌癥的臨床體外診斷上，對細胞的早期癌變診斷意義重大，可作為一種新型的光敏劑。藻藍蛋白藻紅蛋白第十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

流式細胞儀測定常用的熒光染料有多種,它們分子結(jié)構(gòu)不同，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時必須依據(jù)流式細胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633ηm）。488ηm激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白-得克薩斯紅)等。第十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一它們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是：

染料名激發(fā)光波長（ηm）

發(fā)射光峰值（ηm）

FITC

488

525（綠）

PE

488

575（橙紅）

PI

488

630（橙紅）

ECD

488

610（紅）

CY5

488

675（深紅）

PreCP

488

675（深紅）第十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一合適熒光素的選擇：

（1）具有與蛋白質(zhì)形成共價鍵的化學基團。

（2）熒光效率高，標記后下降不明顯。

（3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。

（4）標記后能保持生物學活性和免疫活性。

（5）標記方法簡單、快速。

（6）安全無毒。第十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

免疫熒光抗體技術(shù)(immunofluorescenceantibodytechnique)是指用熒光素對抗體或抗原進行標記，然后用熒光顯微鏡觀察熒光以分析示蹤相應的抗原或抗體的方法。其中，最常用的是以熒光素標記抗體或抗抗體，用于檢測相應的抗原或抗體。第1節(jié)免疫熒光抗體技術(shù)第十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

免疫熒光抗體標記技術(shù)最早是由Coons等于1941年建立的。當時是用異氰酸熒光黃(fluorescein

isocyanate，F(xiàn)IC)來標記抗體，用于檢測小白鼠組織切片中可溶性肺炎球菌多糖。但由于FIC分子難于標記到抗體分子上，因而限制了該技術(shù)的推廣和應用。直到后來發(fā)現(xiàn)異硫氰酸熒光素(FITC)和其他熒光素分子，以及熒光抗體純化技術(shù)的發(fā)展，顯著提高了熒光抗體標記技術(shù)的敏感性和特異性，才使這一技術(shù)在病原微生物的檢測、傳染病的診斷、腫瘤抗原研究等方面得到了廣泛的應用。第十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosis，SLE)患者血清中出現(xiàn)抗細胞核抗體

（ANA）。以小白鼠肝細胞核作為抗原基質(zhì)，加病人血清(第一抗體)，再加熒光標記的抗人IgG(第二抗體)進行間接免疫熒光試驗，若患者血清中有ANA，即與肝細胞核抗原結(jié)合，再與熒光標記的抗人IgG結(jié)合，在熒光顯鏡下可見細胞核顯示黃綠色特異熒光。第十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一二、熒光素

熒光素是能夠產(chǎn)生明顯熒光，并能作為染料使用的有機化合物，又稱為熒光色素。只有具備共軛鍵系統(tǒng)，即單鍵、雙鍵交替的分子，才有可能使激發(fā)態(tài)保持相對穩(wěn)定而發(fā)射熒光，具有此類結(jié)構(gòu)的主要是以苯環(huán)為基礎的芳香族化合物和一些雜環(huán)化合物。

第十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一二、熒光素

作為蛋白質(zhì)標記用的熒光素尚須具備：①有與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定共價鍵的化學基團，而不形成有害產(chǎn)物；②熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合的需要量很?。虎嘟Y(jié)合物在一般貯存條件下穩(wěn)定，結(jié)合后不影響抗體的免疫活性；④作為組織學標記，結(jié)合物的熒光必須與組織的自發(fā)熒光(背景顏色)有良好的反襯，以便能清晰地判斷結(jié)果；⑤結(jié)合程序簡單，能制成直接應用的商品，可長期保存。第十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

可用于標記的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明(RB200)和四甲基異硫氰酸羅丹明(TMRITC，其中應用最廣的是FITC，羅丹明只是作為前者的補充，用作對比染色時標記。第十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一4種主要熒光素的化學結(jié)構(gòu)第二十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一三、熒光抗體染色方法(一)標本制備

1、標記要求：標本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并盡可能減少形態(tài)變化，抗原位置保持不變。同時還必須使抗原-標記抗體復合物易于接受激發(fā)光源，以便良好地觀察和記錄。這就要求標本要相當薄，并要有適宜的固定處理方法。第二十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一三、熒光抗體染色方法(一)標本制備

2、標本處理方法：細菌培養(yǎng)物、感染動物的組織或血液、膿汁、糞便、尿沉渣等，可用涂片或壓印片。組織學、細胞學和感染組織主要采用冰凍切片或低溫石蠟切片。也可用生長在蓋玻片上的單層細胞培養(yǎng)作標本。細胞培養(yǎng)可用胰酶消化后作成涂片。細胞或原蟲懸液可直接用熒光抗體染色后，再轉(zhuǎn)移至玻片上直接觀察。第二十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一三、熒光抗體染色方法(一)標本制備

3、標本固定的目的：有兩個目的，一是防止被檢材料從玻片上脫落；二是消除抑制抗原抗體反應的因素(如脂肪)。檢測細胞內(nèi)的抗原，用有機溶劑固定可增加細胞膜的通透性而有利于熒光抗體滲入。最常用的固定劑為丙酮和95％乙醇。固定后應隨即用PBS反復沖洗，干后即可用于染色。第二十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(二)染色方法熒光抗體染色法有多類，常用的有直接法和間接法。

1、直接法：直接滴加2～4個單位的標記抗體于標本區(qū)，置濕盒中，于37℃染色30min左右，然后大量PBS（pH7.0～7.2）中漂洗15min，干燥、封載即可鏡檢。直接法應設以下對照：標本自發(fā)熒光對照、陽性標本對照和陰性標本對照。直接法用于檢測抗原，每檢測一種抗原均需制備相應的熒光抗體。第二十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一2、間接法：將標本先滴加特異性的抗血清，置濕盒中，于37℃作用30min，漂洗后，再用標記的第2抗體(抗抗體)染色，漂洗、干燥、封載。對照除自發(fā)熒光、陽性和陰性對照外，間接法首次試驗時應設無中間層對照(標本+標記抗抗體)和陰性血清對照(中間層用陰性血清代替特異性抗血清)。既可用于檢測抗原，又可用于檢測抗體，而且制備一種熒光抗抗體即可用于同種屬動物的多種抗原抗體系統(tǒng)的檢測。第二十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一第二十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一五、免疫熒光抗體技術(shù)的應用（一）、細菌學診斷

利用免疫熒光抗體技術(shù)可直接檢出或鑒定新分離的細菌，具有較高的敏感性和特異性。鏈球菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌屬、布氏桿菌、炭疽桿菌等均可采用免疫熒光抗體染色進行檢測和鑒定。糞便、黏膜拭子涂片、病變組織的觸片或切片以及尿沉渣等均可作為檢測樣本，經(jīng)直接法檢出目的菌，具有很高的診斷價值。第二十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一五、免疫熒光抗體技術(shù)的應用（一）、細菌學診斷

對含菌量少的標本，可采用濾膜集菌法，然后直接在濾膜上進行免疫熒光染色，這一方法已在水的衛(wèi)生細菌學調(diào)查、海水細菌動力學研究中得到應用。第二十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

以較低濃度的熒光抗體加入培養(yǎng)基中，進行微量短期的玻片培養(yǎng)，于熒光顯微鏡下直接觀察熒光集落的“熒光菌球法”，已廣泛用于下痢糞便中的病原體檢測。尤其對于已用藥物治療的患者，在病因?qū)W診斷上有較大價值，因為在這種情況下培養(yǎng)病原體常難于成功。

五、免疫熒光抗體技術(shù)的應用（一）、細菌學診斷

第二十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

免疫熒光抗抗體間接染色法檢測抗體，可用于流行病學調(diào)查、早期診斷和現(xiàn)癥診斷。如鉤端螺旋體IgM抗體的檢測，可作為早期診斷或近期感染的指征。用間接法檢出結(jié)核分支桿菌的抗體，可以作為對結(jié)核病的活動性和化療監(jiān)控的重要手段。五、免疫熒光抗體技術(shù)的應用（一）、細菌學診斷

第三十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(二)病毒病診斷

用免疫熒光抗體技術(shù)直接檢出患畜病變組織中的病毒，已成為病毒感染快速診斷的重要手段。一般可在2h內(nèi)做出診斷報告。病原的鑒別診斷。

五、免疫熒光抗體技術(shù)的應用第三十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(二)病毒病診斷對含病毒較低的病理組織，需先在細胞培養(yǎng)上短期培養(yǎng)增殖后，再用熒光抗體檢測病毒抗原，可提高檢出率。某些病毒在細胞培養(yǎng)上不出現(xiàn)細胞病變，亦可應用免疫熒光作為病毒增殖的指征。應用間接免疫熒光染色法以檢測血清中的病毒抗體，亦常作為診斷和流行病學調(diào)查之用，尤以IgM型抗體的檢出可供早期診斷和作為近期感染的指征。五、免疫熒光抗體技術(shù)的應用第三十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(三)其他方面的應用

免疫熒光抗體技術(shù)已廣泛應用于淋巴細胞CD分子和膜表面免疫球蛋白(mIg)的檢測，從而為淋巴細胞的分類和亞型鑒定提供研究手段。用抗IgM和IgG的抗血清標記SPA熒光菌體作熒光SPA花環(huán)試驗，可計算帶有mIgM或mIgG的B細胞的百分率。五、免疫熒光抗體技術(shù)的應用第三十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

免疫酶標記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分析之后發(fā)展起來的一大新型的血清學技術(shù)。

1966年，Nakane等和Avrameas等分別報道用酶代替熒光素標記抗體，建立了酶標抗體技術(shù)(enzyme-labelledantibodytechnique)，用于生物組織中抗原的定位和鑒定。1971年，Engvall，VanWeemen等報道了酶聯(lián)免疫吸附試驗，從而建立了酶標抗體的定量檢測技術(shù)。20世紀80年代，基于酶標記抗體檢測和鑒定蛋白質(zhì)分子的免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)問世。目前，免疫酶標記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測和分子生物學研究中應用最廣泛的免疫學方法之一。第2節(jié)免疫酶標記技術(shù)第三十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一一、原理

酶標抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應的特異性和酶催化反應的高敏感性而建起來的免疫檢測技術(shù)。酶是一種有機催化劑，催化反應過程中酶不被消耗，能反復作用，微量的酶即可導致大量的催化過程，如果產(chǎn)物為有色可見產(chǎn)物，則極為敏感。其催化過程是：E+S(ES)E+P；或E+S(ES),(ES)+D1E+P+D2式中：E為酶；S為酶作用底物；P為底物分解后的產(chǎn)物；D1

為供氫體，無色，底物水解時，D1由還原型變?yōu)檠趸虳2，呈現(xiàn)顏色反應。第三十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一酶標抗體技術(shù)的基本程序是：①將酶分子與抗原或抗體分子共價結(jié)合，既不改變抗體免疫活性，也不影響酶的催化活性；②將酶標抗體(抗抗體)與存在于組織細胞或吸附于固相載體上的抗原(抗體)發(fā)生特異性結(jié)合，并洗下未結(jié)合的物質(zhì)；③滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解過程中由另外的供氫體提供氫離子，使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?，呈現(xiàn)顏色反應。第三十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

可根據(jù)底物溶液的顏色反應來判定有無相應的抗原抗體反應。顏色反應的深淺與標本中相應抗原(抗體)的量呈正比。此種有色產(chǎn)物可用肉眼或在光學顯微鏡或電子顯微鏡下看到，或用分光光度計加以測定。這樣，就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結(jié)合起來，用以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、納克水平上測定它們的量。本法既特異又敏感，是目前應用最為廣泛的一種免疫檢測方法之一。第三十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一二、用于標記的酶

用于標記的酶應具有如下一些特點：①高度的特異活性和敏感性；②在室溫下穩(wěn)定；③易于獲得并能商品化生產(chǎn)；④與底物反應的產(chǎn)物易于顯現(xiàn)。常用的有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以辣根過氧化物酶應用最廣，其次為堿性磷酸酶。第三十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(一)辣根過氧化物酶

過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)。HRP是由五色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白(含糖18％)，分子質(zhì)量約為40ku。HRP的作用底物為過氧化氫，催化時需要供氫體，使產(chǎn)生一定顏色的產(chǎn)物。如果聯(lián)苯胺為供氫體，反應式如下：二、用于標記的酶第三十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一

凡能在HRP催化H2O2生成H20過程中提供氫，而后自己生成有色產(chǎn)物的化合物(供氫體)都可用作顯色劑。

HRP的供氫體很多，根據(jù)供氫體的產(chǎn)物可分為兩類：①可溶性供氫體：產(chǎn)生有色的可溶性產(chǎn)物，可用比色法測定，如酶聯(lián)免疫吸附試驗中的顯色劑，常用的鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)，顯色呈橙色，最大吸收波長為490nm，可用肉眼判定；3,3’,5,5’四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)，顯色呈藍色，加氰氟酸終止，在650nm波長下測定，若用硫酸終止(變?yōu)辄S色)則在450nm波長下測定。二、用于標記的酶(一)辣根過氧化物酶第四十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一②不溶性供氫體：產(chǎn)生不溶性的產(chǎn)物，最常用的是3，3’二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)，反應后的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物，可用光學顯微鏡和肉眼觀察。用于各種免疫酶組織化學染色法、斑點-酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫轉(zhuǎn)印。免疫酶組織化學染色斑點雜交免疫轉(zhuǎn)印第四十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(二)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)：從小牛腸黏膜和大腸桿菌中提取。AKP的底物種類很多，常用對硝基苯磷酸鹽，酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶性，最大吸收波長為400nm。二、用于標記的酶第四十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(三)葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GO)，系從曲霉中提取，對底物葡萄糖的作用常借過氧化物酶及其顯色底物來加以顯現(xiàn)。如顯色底物為鄰苯二胺，則反應后呈棕色，陰性者為淡黃色，極易用目視法判別，其靈敏度高于過氧化物酶標記的抗體。二、用于標記的酶第四十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一戊二醛法或過碘酸鈉氧化法將酶標記于抗體分子。三、抗體的酶標記第四十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一四、常用的免疫酶標記技術(shù)(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)1、標本的制備和處理:用于免疫酶染色的標本有組織切片(冷凍切片和低溫石蠟切片)、組織壓印片、涂片以及細胞培養(yǎng)的單層細胞蓋片等。這些標本的制作和固定與熒光抗體技術(shù)相同，但尚要進行一些特殊處理。第四十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一四、常用的免疫酶標記技術(shù)(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)2、染色方法:可采用直接法、間接法、抗抗體搭橋法、雜交抗體法、酶抗酶復合物法、增效抗體法等各種染色方法，其中直接法和間接法最常用。反應中每加一種反應試劑，均需于37℃作用30min，然后以PBS反復洗滌3次，以除去未結(jié)合物。第四十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(1)直接法以酶標抗體處理標本，然后浸于含有相應底物和顯色劑的反應液中，通過顯色反應檢測抗原抗體復合物的存在。(2)間接法標本用相應的特異性抗體處理后，再加酶標記的抗抗體，然后經(jīng)顯色揭示抗原—抗體—抗抗體復合物的存在。(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)第四十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(3)抗抗體搭橋法

是利用抗抗體既能與反應系統(tǒng)的抗體結(jié)合，又能與抗酶抗體結(jié)合(抗酶抗體與針對抗原的抗體必須是同源的)的特性，以抗抗體作橋連接抗體和抗酶抗體。先加抗體(如兔抗血清)使與標本上的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后加抗抗體(羊抗兔血清)與抗體結(jié)合，再加既能與抗抗體結(jié)合又能與酶結(jié)合的兔抗酶抗體，最后用底物顯色。(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)第四十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(3)抗抗體搭橋法此法的優(yōu)點在于：克服了因酶與抗體交聯(lián)引起的抗體失活和標記抗體與非標記抗體對抗原的競爭，從而提高了敏感性；但抗酶抗體與酶之間的結(jié)合多為低親和性，沖洗標本時易被洗脫，使敏感性降低。(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)第四十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(4)酶抗酶復合物法：亦稱PAP法。此法是將HRP和抗HRP抗體結(jié)合形成酶抗酶抗體復合物(PAP)，用PAP來代替抗抗體搭橋法中的抗酶抗體和酶。其敏感性較搭橋法高。本法亦可用于ELISA。(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)第五十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(5)雜交抗體法：將特異性抗體分子與抗酶抗體分子經(jīng)胰酶消化成雙價F(ab)2片段，將這兩種抗體的F(ab)2片段按適當?shù)谋壤旌希诘蜐舛鹊囊阴Ｒ野泛统涞獥l件下，使之進一步裂解為單價Fab片段，再在含氮條件下使其還原復合。經(jīng)分子篩層析后，即可獲得25％～50％的雜交抗體。這種雜交抗體分子含有兩個抗原結(jié)合部位：一邊能與特異性抗原結(jié)合；另一邊能與酶結(jié)合。因此，不必事先制備標記抗體。檢測標本直接用雜交抗體和酶處理，即可浸入底物溶液中，進行顯色反應。雜交抗體還可采用雜交瘤技術(shù)和基因工程抗體技術(shù)進行制備。(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)第五十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(6)增效抗體法：同時使用酶標抗體與抗酶抗體，其程序為：抗原、酶標記抗體、抗抗體、抗酶抗體、酶、底物。此法能使更多的酶連接在抗原上，從而使顯色反應增強，提高其敏感性。(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)第五十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一3、顯色反應免疫酶組化染色中的最后一環(huán)是用相應的底物使反應顯色。不同的酶所用底物和供氫體不同。同一種酶和底物如用不同的供氫體，則其反應物的顏色也不同。如辣根過氧化物酶，在組化染色中最常用DAB，用前應以0．05mol／LpH7．4～7．6的Tris-HCl緩沖液配成50～75mg／100mL溶液，并加少量(0．01％～0．03％)H202混勻后加于反應物中置室溫10～30min，反應產(chǎn)物呈深棕色；如用甲萘酚，則反應產(chǎn)物呈紅色；用4-氯-1-萘酚，則呈淺藍色或藍色。(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)第五十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一4、標本觀察顯色后的標本可在普通顯微鏡下觀察，抗原所在部位呈色。亦可用常規(guī)染料作反襯染色，使細胞結(jié)構(gòu)更為清晰，有利于抗原的定位。本法優(yōu)于免疫熒光抗體技術(shù)之處，在于毋須應用熒光顯微鏡，且標本可以長期保存。(一)免疫酶組織化學染色技術(shù)第五十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(二)酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)，ELISA是應用最廣、發(fā)展最快的一項新技術(shù)。其基本過程是將抗原(或抗體)吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶反應，底物顯色后用肉眼或分光光度計判定結(jié)果。第五十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一第五十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一酶標抗原競爭法：用特異性抗體包被固相載體，加入含待測抗原的溶液和一定量的酶標記抗原共同孵育，對照僅加酶標抗原，洗滌后加入酶底物。被結(jié)合的酶標記抗原的量由酶催化底物反應產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來確定。如待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的酶標記抗原的量越少，顯色就越淺?？捎貌煌瑵舛鹊臉藴士乖M行反應繪制出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值求出檢測樣品中抗原的含量。第五十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一抗體稀釋及加樣方法500l樣品稀釋液女女500lE-Ab陰原1:21:41:81:161:321:64空第2列：陰性對照（Ag+/Ab-）第10列：空白對照（Ag-/Ab-）

1.準備6個稀釋管，做好標記。2.先在每個稀釋管中加入稀釋液500ul。3.取出500ul抗體加入第一管，混勻后，取出500ul加入第二管，依此類推至最后管。第五十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一封閉的作用包被時所用的抗原或抗體濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而防止非特異性吸附，影響結(jié)果的準確性。如圖：第五十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一TMB（四甲基聯(lián)苯胺）TMB經(jīng)HRP作用后其產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。酶反應用HCL或H2SO4終止后，產(chǎn)物由藍色變成黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。TMB有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。第六十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一固相載體有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。用聚苯乙烯微量滴定板(40孔或96孔板)是目前最常用的載體，小孔呈凹形，操作簡便，有利于大批樣品的檢測。新板在應用前一般無需特殊處理，直接使用或用蒸餾水沖洗干凈，自然干燥后備用。一般均一次性使用，如用已用過的微量滴定板，需進行特殊處理。第六十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一結(jié)果判定

ELISA試驗結(jié)果可用肉眼觀察，也可用ELISA測定儀測定樣本的光密度(0D)值。每次試驗都需設陽性和陰性對照，肉眼觀察時，如樣本顏色反應超過陰性對照，即判為陽性。用ELISA測定儀來測定OD值，所用波長隨底物供氫體不同而異，如以OPD為供氫體，測定波長為492nm，TMB為650nm(氰氟酸終止)或450nm(硫酸終止)。第六十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一(三)斑點-酶聯(lián)免疫吸附試驗

斑點-酶聯(lián)免疫吸附試驗(Dot-ELISA)，此法的原理及其步驟與ELISA基本相同，不同之處在于：一是將固相載體以硝酸纖維素濾膜、硝酸醋酸混合纖維素濾膜、重氮芐氧甲基化紙等固相化基質(zhì)膜代替，用以吸附抗原或抗體；二是顯色底物的供氫體為不溶性的。結(jié)果以在基質(zhì)膜上出現(xiàn)有色斑點來判定。可采用直接法、間接法、雙抗體法、雙夾心法等。第六十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一第六十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一第六十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一一、原理

放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是將放射性同位素測量的高度敏感性和抗原抗體反應的高度特異性結(jié)合起來而建立的一種免疫分析技術(shù)。1959年，Yalow和Berson共同建立了放射免疫分析，由于這種檢測方法可以精確地測定體液中的微量活性物質(zhì)，是免疫定量分析技術(shù)的一次重大突破和飛躍，因而受到各有關(guān)基礎學科工作者的重視，并于1977年榮獲諾貝爾生物學醫(yī)學獎。放射免疫分析經(jīng)過多年的發(fā)展和完善，已由經(jīng)典的液相方法發(fā)展到固相操作，方法越益簡化，并可自動化分析。第3節(jié)放射免疫分析第六十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一放射免疫分析的基本原理是標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）的競爭結(jié)合反應。根據(jù)免疫沉淀物中Ag*-Ab量減少或增多來測定Ag的量。第六十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一第六十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期一二、常用的放射免疫分析技術(shù)(一)液相放射免疫測定