細(xì)胞增殖和活力

細(xì)胞增殖和活力第一頁(yè)，共25頁(yè)。細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力中心實(shí)驗(yàn)室李娜第二頁(yè)，共25頁(yè)。檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的方法一種是直接的方法，通過(guò)直接測(cè)定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。一種是間接的方法，即細(xì)胞活力（cellviability）檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞活力檢測(cè)法并不能最終證明檢測(cè)樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會(huì)自發(fā)啟動(dòng)凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時(shí)若采用細(xì)胞活力檢測(cè)法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細(xì)胞數(shù)大于對(duì)照組的事實(shí)說(shuō)明藥物可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以最直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。第三頁(yè)，共25頁(yè)。細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)直接計(jì)數(shù)胸腺嘧啶核苷(3H‐TdR)滲入法5.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)檢測(cè)法5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（EdU）羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)檢測(cè)法CCK8MTT檢測(cè)法ATP檢測(cè)第四頁(yè)，共25頁(yè)。1.直接計(jì)數(shù)利用計(jì)數(shù)板或計(jì)數(shù)儀得出細(xì)胞的數(shù)目，然后對(duì)數(shù)目進(jìn)行比較。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單：不需要特定的試劑和儀器準(zhǔn)確缺點(diǎn)：不適合樣品數(shù)量多的情況不適合評(píng)估特定的亞群第五頁(yè)，共25頁(yè)。臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。第六頁(yè)，共25頁(yè)。2.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)滲入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)。用同位素H標(biāo)記TdR即H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DNA合成代謝過(guò)程，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞DNA鏈內(nèi)標(biāo)記核苷酸的量的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DNA的代謝及細(xì)胞增殖情況。優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時(shí)還存在放射性核素污染問(wèn)題。第七頁(yè)，共25頁(yè)。3.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)檢測(cè)法Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入，而后利用Brdu專(zhuān)一性抗體，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類(lèi)，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。BrdU標(biāo)記很適合免疫組化IHC、免疫細(xì)胞化學(xué)IC、細(xì)胞內(nèi)ELISA、流式細(xì)胞分析和高通量篩選。優(yōu)點(diǎn)：不僅能用于體外實(shí)驗(yàn)，還能用于活體實(shí)驗(yàn)，缺點(diǎn)：就是需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，但這就破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響了其他染料的結(jié)合染色，導(dǎo)致染色彌散，準(zhǔn)確性降低等問(wèn)題第八頁(yè)，共25頁(yè)。4.5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（EdU）也是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物。它也能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子，通過(guò)基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)檢測(cè)DNA復(fù)制活性，通過(guò)檢測(cè)EdU標(biāo)記便能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況。EdU檢測(cè)染料只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無(wú)需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測(cè)，可有效避免樣品損傷，在細(xì)胞和組織水平能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖等現(xiàn)象。9第九頁(yè)，共25頁(yè)。5.羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)檢測(cè)法羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)，使CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。這樣，在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對(duì)遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析。第十頁(yè)，共25頁(yè)。5.羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)檢測(cè)法CFSE能夠輕易穿透細(xì)胞膜，在活細(xì)胞內(nèi)聚積并與胞內(nèi)蛋白共價(jià)結(jié)合，水解后的CFSE釋放出熒光物質(zhì)，這些共價(jià)結(jié)合的熒光物分子很少?gòu)募?xì)胞內(nèi)脫落。CFSE標(biāo)記后的細(xì)胞用于體內(nèi)觀察可以長(zhǎng)達(dá)數(shù)周。因此，CFSE常被用來(lái)做活細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn)和用熒光電鏡觀察細(xì)胞長(zhǎng)期活動(dòng)的試驗(yàn)。利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析。CFSE標(biāo)記的細(xì)胞的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為500nm和520nm第十一頁(yè)，共25頁(yè)。6.CCK8檢測(cè)法是一種基于WST‐8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)方法。CCK‐8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中含有WST‐8：2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯基)‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐四唑單鈉鹽]。WST‐8是一種類(lèi)似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線(xiàn)粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚產(chǎn)物formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線(xiàn)性關(guān)系。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。第十二頁(yè)，共25頁(yè)。7.MTT檢測(cè)法MTT檢測(cè)法主要反映細(xì)胞的能量代謝，是檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的方法。其原理是在活細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中，線(xiàn)粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的水不溶性的甲瓚(Formazan)，并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞無(wú)此功能?；罴?xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力成正比。MTT方法用于判斷藥物、外源性基因、小RNA、蛋白、抗體、細(xì)胞因子、血清等對(duì)于細(xì)胞的作用，以明確上述因子對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)行為的影響（如細(xì)胞活力、增殖、凋亡等方面）。第十三頁(yè)，共25頁(yè)。8.ATP檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP含量受到了嚴(yán)格調(diào)控，檢測(cè)ATP也可以得到細(xì)胞增殖的信息。死亡細(xì)胞或即將死亡的細(xì)胞幾乎不含ATP，在細(xì)胞溶解物或提取物中測(cè)得的ATP濃度與細(xì)胞數(shù)之間存在嚴(yán)格的線(xiàn)性關(guān)系。利用熒光素酶luciferase及其底物熒光素luciferin的ATP檢測(cè)以生物發(fā)光為基礎(chǔ)，能夠提供非常靈敏的結(jié)果。如果有ATP存在熒光素酶就會(huì)發(fā)光，而且其發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度成正比，用能讀取發(fā)光信號(hào)的光度計(jì)和酶標(biāo)儀都可以方便的進(jìn)行檢測(cè)。這種方法非常適用于高通量細(xì)胞增殖檢測(cè)和篩選。第十四頁(yè)，共25頁(yè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線(xiàn)細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104

第十五頁(yè)，共25頁(yè)。選擇策略怎樣選擇最適合的檢測(cè)方法，主要依賴(lài)于使用的細(xì)胞類(lèi)型和具體研究方案，還取決于實(shí)驗(yàn)者在細(xì)胞增殖中期望得到的信息。假如希望了解細(xì)胞增殖中的代謝活性變化，可以使用四唑鹽和比色法檢測(cè)；如果關(guān)注重點(diǎn)在于對(duì)DNA合成的改變，可以選擇用BrdU或EdU標(biāo)記，再通過(guò)比色法、化學(xué)發(fā)光或熒光檢測(cè)進(jìn)行分析；若研究的是單個(gè)細(xì)胞，也可以用BrdU或EdU標(biāo)記來(lái)檢測(cè)DNA合成，將其與熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體結(jié)合，就可以通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)進(jìn)行流式分選。第十六頁(yè)，共25頁(yè)。選擇策略應(yīng)該注意，測(cè)定細(xì)胞增殖很多時(shí)候單一方法都是有缺陷的，四唑鹽—MTT法不夠精確；最直接的指標(biāo)是活細(xì)胞數(shù)量的變化，結(jié)果比較準(zhǔn)確，但細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法所需細(xì)胞量較多，操作繁瑣費(fèi)時(shí)；而3H摻入法麻煩且不安全。所以，建議最好用兩種以上的方法進(jìn)行測(cè)定，這樣做主要是可以有一個(gè)用于輔助修正的數(shù)據(jù)。第十七頁(yè)，共25頁(yè)。注意事項(xiàng)-選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過(guò)滿(mǎn)。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線(xiàn)性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。第十八頁(yè)，共25頁(yè)。注意事項(xiàng)-設(shè)置調(diào)零孔實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)加藥組加入不同濃度的藥物。每組設(shè)定3復(fù)孔設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。第十九頁(yè)，共25頁(yè)。注意事項(xiàng)-藥物濃度的設(shè)定一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。第二十頁(yè)，共25頁(yè)。注意事項(xiàng)-時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定在不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫(huà)出變化的曲線(xiàn)，曲線(xiàn)什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。第二十一頁(yè)，共25頁(yè)。注意事項(xiàng)-培養(yǎng)時(shí)間200ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的4~5次方的增殖期細(xì)胞來(lái)說(shuō)，很難維持68h，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話(huà)，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。

第二十二頁(yè)，共25頁(yè)。注意事項(xiàng)MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕