分子生物學(xué)綜述

-.z糖蛋白抗腫瘤的研究進(jìn)展[摘要]糖蛋白是由短的寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價(jià)相連構(gòu)成的分子，是細(xì)胞的識(shí)別及體內(nèi)功能多為糖蛋白介導(dǎo)。其獨(dú)特免疫原性使其在抗腫瘤方面具顯著效果。在這近幾年來(lái)，糖蛋白開(kāi)展迅速，本文就糖蛋白構(gòu)造、功能及抗腫瘤方面研究進(jìn)展進(jìn)展綜述。[關(guān)鍵詞]糖蛋白；生物學(xué)功能；抗腫瘤；前言

糖蛋白在生物體內(nèi)是重要的生物活性物質(zhì)，其糖鏈和蛋白相互作用介導(dǎo)細(xì)胞的專一性識(shí)別，調(diào)控各種生命過(guò)程如受精、發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)的維持，在目前炎癥及癌細(xì)胞異常增殖、自身免疫系統(tǒng)中起重要作用。筆者就其糖蛋白的功能、及抗腫瘤方面國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀做一綜述。1生物學(xué)功能1－1構(gòu)成α-構(gòu)型血抗原的根本物質(zhì)構(gòu)成血型的抗原為血型糖蛋白，是一組含大量唾液酸糖鏈的跨膜蛋白，無(wú)論ABO血型系統(tǒng)或MN血型系統(tǒng)都是由血型糖蛋白決定。寡糖鏈的識(shí)別作用決定著細(xì)胞的識(shí)別、集聚和受體作用。1－2構(gòu)成細(xì)胞外表受體，與細(xì)胞識(shí)別和黏著有關(guān)一些外源凝集素、毒素以及病原體的受體均是糖蛋白。一些植物凝集素可使血液細(xì)胞發(fā)生凝集，動(dòng)物凝集素不僅在體液免疫中起作用，還和腫瘤轉(zhuǎn)移作用有關(guān)[1]。不同性別性細(xì)胞相互作用成合子或聚集成組織，都以糖和與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì)間的識(shí)別和結(jié)合為前奏，特別是與糖鏈的構(gòu)造與識(shí)別功能有關(guān)，為醫(yī)療上避孕提供了新的可能途徑[2]。利用精細(xì)胞外表糖蛋白特異結(jié)合的特性，將外源基因?qū)氤墒炀?，使外源DNA進(jìn)入卵中受精，可借此產(chǎn)生優(yōu)良品種[3]。1－3物質(zhì)運(yùn)輸功能一些糖蛋白如運(yùn)血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等可與各種特有的物質(zhì)結(jié)合，將其運(yùn)輸。糖蛋白兼有傳遞信息功能，在糖蛋白激素中，糖鏈在激素信號(hào)傳入細(xì)胞過(guò)程中擔(dān)負(fù)重要作用[4]。1－4其他功能糖蛋白還和免疫反響及神經(jīng)傳導(dǎo)有關(guān)。如一種GlycodelinA糖蛋白在生殖免疫過(guò)程中，在母胎抗排斥免疫中發(fā)揮重要作用[4]。*些細(xì)胞膜的糖蛋白還有酶活性。在以上諸多糖蛋白的生理功能中可以看出，糖鏈的構(gòu)造起決定性的作用。2糖蛋白抗腫瘤的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀從體液及各種生物中別離出的糖蛋白，具有各種抗菌、抗凝血、抗腫瘤等生物活性。糖蛋白類及細(xì)胞的定向歸巢、糖蛋白毒素及激素作用機(jī)制，可使藥物選擇性地集中到病灶，提高藥效，而不影響正常組織的生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)的功能，降低不良反響。例如，將乳糖接到門(mén)冬酰胺酶上，利用乳糖定向歸巢到肝細(xì)胞，使門(mén)冬酰胺酶進(jìn)入肝細(xì)胞，可治療肝癌。不同來(lái)源的糖鏈構(gòu)造有相似之處，說(shuō)明以體液糖蛋白代替膜上復(fù)合糖類或在高等動(dòng)物以外尋找利用于人體的半抗原糖類作為藥物是可能的。人體內(nèi)存在一些唾液酸含量較高的糖蛋白，如α1酸性糖蛋白(AAG)和Tam-horsefall蛋白，能抑制流感病毒和宿主細(xì)胞的黏著。多數(shù)糖蛋白糖含量在20%以下，而AAG的糖含量到達(dá)40%以上[5]。AAG免疫抑制活性表現(xiàn)在能抑制血小板凝集，也與腫瘤有關(guān)。AAG還能與藥物結(jié)合起到藥物傳送的作用。研究還發(fā)現(xiàn)了幾種與腫瘤相關(guān)的糖蛋白。利用血清或尿液中糖蛋白糖鏈的構(gòu)造異常來(lái)診斷惡性腫瘤，如利用凝集素將甲胎蛋白(AFP)分成多種糖鏈構(gòu)造不同的異構(gòu)體，可用于原發(fā)性肝癌的診斷[6]；Pg-P是一種跨膜糖蛋白，是介導(dǎo)乳腺癌耐藥機(jī)制逆轉(zhuǎn)耐藥的重要靶點(diǎn)，近年已有不少新的逆轉(zhuǎn)藥物被發(fā)現(xiàn)并試用于臨床[7]；TAG72可作為消化道腫瘤重要的血清指標(biāo)；黏糖蛋白-2(MUC2)在大腸癌中的陽(yáng)性率為70%[8]；CA125是胚胎發(fā)育期腔上皮表達(dá)的一種高分子糖蛋白，可以作為卵巢癌的標(biāo)記物；前列腺特異性抗原(PSA)是前列腺上皮細(xì)胞合成并分泌至精液中的一種相對(duì)分子質(zhì)量為3300~3400、含糖量為7%的前列腺癌相關(guān)糖蛋白，作用于消化精囊特異性抗原，使其作為腫瘤標(biāo)記物的特殊糖蛋白，在腫瘤存在時(shí)，可異常增加，對(duì)診斷頗為重要[9]；CD44是細(xì)胞外表的整合膜糖蛋白，CD44H能使腫瘤形成提早，腫瘤形成率從30%提高到90%，瘤生長(zhǎng)速度加快。而CD44E卻抑制瘤生長(zhǎng)，瘤形成率幾乎為零，其表達(dá)水平與黑色素遷移率有正向關(guān)系[10]。CA242是一種唾液酸化的黏蛋白類的腫瘤相關(guān)抗原，在胰腺癌中檢出率較高[11]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤關(guān)糖蛋白種類很多，說(shuō)明惡性腫瘤組織細(xì)胞的生成與糖蛋白的合成、分泌有密切關(guān)系。綠十字社和美國(guó)田納西大學(xué)將尿激酶別離精制得到一種相對(duì)分子質(zhì)量2~4萬(wàn)的糖蛋白，試驗(yàn)說(shuō)明其對(duì)人正常細(xì)胞沒(méi)有作用，而對(duì)乳腺癌、肺癌等的癌細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用[12]。**海軍醫(yī)藥學(xué)專業(yè)中心近年從海蛤和無(wú)齒蚌中提取別離出抗動(dòng)物移植腫瘤的活性物質(zhì)，經(jīng)鑒定組分為糖蛋白，高劑量對(duì)小鼠S180抑瘤率達(dá)72%以上。Sasaki等對(duì)軟體動(dòng)物(Mollusks)海蛤、牡蠣、馬賊、海螺、魷魚(yú)等進(jìn)展了研究，證明Paolins為具抗菌和抗病毒活性的一種糖蛋白，只需少量或中等活力就可抑制小鼠S180；且還具抗白血病作用。3結(jié)語(yǔ)糖蛋白對(duì)人類**的重要作用越來(lái)越受到重視。利用海洋生物的構(gòu)造多樣性及獨(dú)特的生物活性，國(guó)外已有研究報(bào)道其顯著的抗腫瘤及抗艾滋病活性，尋求生物利用性好的活性糖蛋白大分子，利用現(xiàn)代分析技術(shù)研究其構(gòu)造，從分子水平闡釋其對(duì)疾病的作用機(jī)理。目前利用糖蛋白的靶向性設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物，以及應(yīng)用免疫原性制備多糖結(jié)合疫苗，激發(fā)免疫系統(tǒng)到達(dá)治療目的，通過(guò)生物療法提高治療效果，已成為越來(lái)越重要的治療手段。[參考文獻(xiàn)]

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裸DNA將目的基因連接在表達(dá)的質(zhì)?；蚴删w中直接注射而不依賴其它物質(zhì)的介導(dǎo)，是最簡(jiǎn)單的非病毒載體系統(tǒng)。電穿孔〔electroporation〕技術(shù)和微粒子轟擊法〔microparticlebombardment,此法也稱作基因槍〕的出現(xiàn)，大大提高了裸DNA的轉(zhuǎn)染效率，而且使DNA可直接到達(dá)細(xì)胞核，防止了各種酶對(duì)DNA的降解。目前使用的DNA疫苗，就是用編碼病毒抗原的質(zhì)粒直接肌內(nèi)注射，可獲得有效的抗病毒免疫。裸DNA雖能有效運(yùn)轉(zhuǎn)并表達(dá)目的基因,但缺乏靶向性,并且只能在局部作用,不能轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞,經(jīng)常需要進(jìn)展外科手術(shù)以暴露靶器官,使用時(shí)局限性較大。[2]2

脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物脂質(zhì)體一般由陽(yáng)離子脂質(zhì)和中性共脂質(zhì)組成，前者由陽(yáng)性親水性首基、交聯(lián)劑、疏水性局部三個(gè)根本構(gòu)造域組成，為陽(yáng)性兩親化合物，壓縮DNA形成脂質(zhì)復(fù)合體。顆粒大小、zeta電位、DNA/脂質(zhì)體比、溶液離子強(qiáng)度等均影響脂質(zhì)復(fù)合體的形成、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。改進(jìn)三個(gè)根本構(gòu)造域的設(shè)計(jì)可提高脂質(zhì)體的效能：選擇可識(shí)別DNA的首基，如天然的構(gòu)造或功能基團(tuán)、非氨基性陽(yáng)離子局部；引入可應(yīng)答各種生物學(xué)刺激的易變性交聯(lián)劑，以誘導(dǎo)DNA定時(shí)釋放；修飾疏水性局部以獲得最正確構(gòu)造[3]。預(yù)先通過(guò)魚(yú)精蛋白壓縮DNA，再與脂質(zhì)體絡(luò)合，可使脂質(zhì)重排，形成構(gòu)造致密的脂質(zhì)體/魚(yú)精蛋白/DNA絡(luò)合物，顆粒大小較脂質(zhì)復(fù)合體減少3到5倍，基因投遞率提高[4]。Junghans等[5]用脂質(zhì)體魚(yú)精蛋白/DNA絡(luò)合物投遞反義c-myc寡核苷酸，發(fā)現(xiàn)寡核苷酸穩(wěn)定性增加，下調(diào)U937細(xì)胞系c-myc表達(dá)。經(jīng)聚乙二醇外表修飾可提高絡(luò)合物轉(zhuǎn)染效率和靶向性。脂質(zhì)體成分所致的毒性反響限制了其臨床應(yīng)用，應(yīng)用各種濃度的輔助脂質(zhì)可優(yōu)化脂質(zhì)復(fù)合體。另外，Liu等[6]報(bào)告于脂質(zhì)復(fù)合體中參加免疫抑制基因可顯著減少TNF-α(腫瘤壞死因子-α)的產(chǎn)生，并且不影響生物學(xué)分布。類似刺激應(yīng)答多聚體，可設(shè)計(jì)環(huán)境敏感型脂質(zhì)體以加強(qiáng)DNA釋放，從而增強(qiáng)目的基因表達(dá)[7]。3陽(yáng)離子多聚物陽(yáng)離子多聚物包括合成的或天然的大分子。合成的聚合物有肽，如聚左旋賴基酸、聚左旋鳥(niǎo)氨酸、聚4-羥基-脯氨酸酯聚胺類，如聚乙烯亞胺(PEI)(線狀或分支狀)、聚丙烯亞胺(PPI)；聚酰胺類，如PAMM樹(shù)枝石[8]。天然的聚合物包括一些蛋白，如組蛋白和人血清蛋白；多糖類，如殼聚糖等[9]。陽(yáng)離子多聚物與脂質(zhì)體相比，由于聚陽(yáng)離子由特定重復(fù)構(gòu)造組成，可以通過(guò)化學(xué)修飾提高轉(zhuǎn)染率及靶向性，且有血清敏感性，所以引起很大的關(guān)注，是一類很有前景的非病毒載體系統(tǒng)。

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聚乙烯亞胺〔PEI〕依乙酰亞胺單元連接方式的不同，多聚乙酰亞胺可為線性或分支狀。材料特性(如相對(duì)分子質(zhì)量、分支程度、陽(yáng)離子電荷密度及緩沖能力)、多聚復(fù)合物特性(如DNA含量、顆粒大小及zeta電位)及實(shí)驗(yàn)條件(如多聚復(fù)合物濃度、轉(zhuǎn)染過(guò)程中血清存在與否、孵育時(shí)間、轉(zhuǎn)染模型)均可影響分支型多聚乙酰亞胺的效應(yīng)/細(xì)胞毒性比。線性多聚乙酰亞胺似乎優(yōu)于分支狀，因前者可非細(xì)胞周期依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)DNA入胞核，明顯提高細(xì)胞存活率及轉(zhuǎn)染效率[10]，但目前應(yīng)用分支型轉(zhuǎn)染者居多。多聚乙酰亞胺可有效壓縮DNA、保護(hù)DNA和破壞內(nèi)體膜，為轉(zhuǎn)染效率最高的陽(yáng)離子多聚體之一，但毒性反響限制其在基因治療中的廣泛應(yīng)用。修飾聚乙二醇化、甲基化、膽固醇化等可防止毒性反響同時(shí)保持其高轉(zhuǎn)染效率。結(jié)語(yǔ)總之，非病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源基因不會(huì)整合入宿主細(xì)胞的染色體中，不會(huì)使插入位點(diǎn)附近的基因過(guò)度表達(dá)或失活，也無(wú)插入突變的危險(xiǎn)，因此，其平安性可能優(yōu)于病毒載體。但非病毒載體的研究還不是很成熟,因此還必須深入研究外源基因進(jìn)入細(xì)胞的各種屏障及其細(xì)胞和分子機(jī)制?？梢韵嘈?，通過(guò)對(duì)非病毒基因載體根底和應(yīng)用的深入研究以及各學(xué)科的共同努力下，將會(huì)使非病毒基因載體的基因治療取得最大的療效，同時(shí)最大限度地降低不良反響。參考文獻(xiàn)[1]朱玉賢，李毅.現(xiàn)代分子生物學(xué)(第二版).高等教育,331[2]朱玉賢，李毅.現(xiàn)代分子生物學(xué)(第二版).高等教育,331-332[3]MartinB，SainlosM，AissaouiA，eta1．Thedesignofcationiclipidsforgenedelivery．CurrPharmDes，2005，l1：375-394．[4]E1-AneedA.Anoverviewofcurrentdelivcrysystemsincancergenetherapy．JControlRelease．2004．94：1-14．[5]JunghfillsM，LoitsehSM，SteinigerSC，eta1．Cationiclipid-protamine-DNA(LPD)ple*esfordeliveryofantisensec-mycoligonueleotides．EurJPharmBiophann，2005．60：287-294．[6]LiuF，ShollenbergerLM，HuangL．Nonimmunostimulatorynonviralvectors．FASEBJ．2004．18：1779-1781．[7]ConwellCC，HuangL．Recentgdvo*leesinnon-viralgenedelivery．AdvGenet。2005，53：3-18．[8]NakanishiM，NoguchiA.Confocalandprobemicroscopytostudygenemediatedbycationicliposomeswithacationiccholesterolderivative．AdvancedDrugDelveryReviews，2001，52：197-207．[9]SethuramanVA，NaK，BaeYH．pH-responsivesulfonamide／PEIsystemfortumorspecificgenedelivery：aninvitrostudy．Biomacromolecules，2006，7：64-70．[10]LungwitzU。BreunigM，BlunkT，eta1．Polyethylenimine—basednonviralgenede．1iverysystems．EurJPharmBiopharm，2005．60：247-266．蛋白質(zhì)組學(xué)研究相關(guān)技術(shù)進(jìn)展【摘要】蛋白質(zhì)組學(xué)是以生物體系整體蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的新的研究領(lǐng)域。近年來(lái),蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得了令人鼓舞的進(jìn)展,一些新技術(shù)也得到迅猛的開(kāi)展和改進(jìn),如雙向凝膠電泳、生物質(zhì)譜、生物傳感芯片質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片和生物信息學(xué)等?！娟P(guān)鍵詞】蛋白質(zhì)組學(xué);雙向凝膠電泳;生物質(zhì)譜;生物芯片;生物信息學(xué)2003年4月14日,科學(xué)家宣布人類基因組方案已順利完成,99%的人類遺傳密碼被破譯,人類基因組圖譜比預(yù)期提前2年繪制完成,并提示與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因只占基因組的2%。盡管DNA可以提供很多的信息,但蛋白質(zhì)才是細(xì)胞功能的全部表達(dá)。因此,研究的重點(diǎn)將轉(zhuǎn)向基因的表達(dá)與調(diào)控以及表達(dá)產(chǎn)物的功能研究。蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生和概念蛋白質(zhì)組指的是全部基因表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其存在方式,是一種細(xì)胞、組織或完整生物體在特定時(shí)空上所擁有的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)不同于傳統(tǒng)的單個(gè)蛋白質(zhì)或*一類蛋白質(zhì)研究,它研究的是體系內(nèi)全部的蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,包括:蛋白質(zhì)大規(guī)模鑒定及翻譯后修飾的微特征研究;差異顯示蛋白質(zhì)組學(xué),即對(duì)腫瘤等異常疾病有著廣泛應(yīng)用前景的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比較;應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)、串聯(lián)親和純化技術(shù)和酵母雙雜交體系對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。[1]蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要依賴4大技術(shù):蛋白質(zhì)別離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)相互作用分析及生物信息學(xué)(包括構(gòu)建、分析雙向電泳凝膠圖譜以及數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建與搜索)。蛋白質(zhì)別離技術(shù)1.雙向凝膠電泳〔2-DE〕目前惟一可在一塊膠上同時(shí)別離成千上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)組分的方法,尤其是固相pH梯度凝膠電泳的創(chuàng)造和完善,可防止因載體兩性電解質(zhì)引起的重復(fù)性差、pH梯度不穩(wěn)定、出現(xiàn)陰極漂移等缺點(diǎn),改善雙向電泳的穩(wěn)定性和重復(fù)性。2.高效液相色譜技術(shù)(HELP):HPLC蛋白質(zhì)得到高靈敏度的層析分析,它基于樣品分子在固定相(即柱填料)和流動(dòng)相(即淋洗液)之間的特殊相互作用而實(shí)現(xiàn)別離。樣品無(wú)需變性處理,可直接別離;并可實(shí)現(xiàn)上樣、收集、在線分析的自動(dòng)化,且無(wú)需對(duì)別離結(jié)果進(jìn)展染色處理。3.差異凝膠電泳(DIGE):應(yīng)用兩種不同的熒光染料分別標(biāo)記不同的蛋白質(zhì)樣品后等量混合,2-DE后置于熒光顯微鏡下觀察,如同一斑點(diǎn)可見(jiàn)兩種熒光即說(shuō)明此蛋白質(zhì)可同時(shí)在兩種樣品中表達(dá);反之,則說(shuō)明蛋白質(zhì)只在相應(yīng)樣品中表達(dá)。4.毛細(xì)管電泳(CE)技術(shù):CE技術(shù)是在高電場(chǎng)強(qiáng)度作用下,對(duì)毛細(xì)管(內(nèi)徑5~10μm)中的待測(cè)樣品按分子質(zhì)量、電荷、電泳遷移率等差異進(jìn)展有效別離,主要包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管等電聚焦以及篩板-SDS毛細(xì)管電泳等技術(shù)。CE技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的別離可實(shí)現(xiàn)在線自動(dòng)分析,并可用于分子量*圍不適于2-DE的樣品,但也存在對(duì)復(fù)雜樣品別離不完全的缺點(diǎn)。[1]蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)1.質(zhì)譜(massspectrometry,MS)技術(shù):經(jīng)2-DE別離得到的蛋白質(zhì)通常數(shù)目多、量少;MS以其高通量、高靈敏度,可自動(dòng)化,與蛋白質(zhì)組大規(guī)模研究相適應(yīng)以及能提供準(zhǔn)確的分子量和構(gòu)造信息等優(yōu)點(diǎn),已根本取代了傳統(tǒng)的埃德曼降解法測(cè)定N端序列,成為蛋白質(zhì)鑒定的支撐技術(shù)。MS是將樣品分子離子化后,根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比的差異來(lái)別離并確定相對(duì)分子質(zhì)量。2.同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽法(ICAT):將兩種不同樣品分別標(biāo)記輕同位素和重同位素后混合、酶切、親和層析,再進(jìn)展在線高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析即可定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況,能較準(zhǔn)確的鑒定不同狀態(tài)下細(xì)胞或組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)相互作用分析:(1)生物傳感芯片(biosensorchip)質(zhì)譜:它是生物分子相互作用分析技術(shù)(biomolecularinteractionanaly-sis,BIA)與MALDI-TOF-MS有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物,核心為一小塊由金黃色