臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨愈合的體外實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用1例

中國組織工程研究與臨床康復(fù) 第15卷第45期2011–11–05出版JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch November5,2011 Vol.15,No.45☆臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨愈合的體外實(shí)驗(yàn)及臨床1應(yīng)例用李華濤1，邊琳芬1，吳勝剛1，李 強(qiáng)1，王黎麗1，戴育成2，劉 洋3InvitroexperimentofumbilicalcordmesenchymalstemcellstopromotebonehealingandclinicalapplicationinonecaseLiHua-tao1,BianLin-fen 1,WuSheng-gang 1,LiQiang1,WangLi-li1,DaiYu-cheng2,LiuYang31Burnsunit,the98HospitalofChinesePLA,Huzhou313000,ZhejiangProvince,China;MolecularMedicineCenterofSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversityMedicalSchool,Nanchang330000,JiangxiProvince,3China; ConsonanceEasternChinaCompanyofStemCellGeneEngineering,Huzhou313000,ZhejiangProvince,ChinaLiHua-tao☆,Doctor,Associatechiefphysician,Burnsunit,the98HospitalofChinesePLA,Huzhou313000,ZhejiangProvince,Chinaeehuatao@163.com

AbstractBACKGROUND:Umbilicalcordmesenchymalstemcells(UCMSCs)aremoreoriginalthanadultones.StudieshaveshownthatUCMSCshavehighertelomeraseactivity,shorterculturedoublingtimeandwiderlineagedifferentiation.OBJECTIVE: ToexplorethepotencyofUCMSCsdifferentiatedintoosteoblasts invitroandtheirclinicaleffectsonbonenonunion.METHODS: UCMSCswereisolatedfromWharton ’sjellyofhumanumbiIicalcord;afterserialsubcultureinvitro,MSCsweretestedfortheirimmunophenotypeandosteogenicdifferentiation.ClinicalapplicationofUCMSCstransplantationwasalsoperformedtoapatientwithrefractoryexposedbonefractureevokedbyinfection.RESULTSANDCONCLUSION:UCMSCsexhibitedfibroblasticmorphologyandlong-termstableculture.ThesepassagedcellspresentedMSCsimmunophenotypeandtherewereagreatamountofcalciumdepositionandnodesinintracytoplasmdetectedbyalizarinredandVonKossastaining,respectively,afterosteogenicdifferentiation.ThepatientwastreatedwithUCMSCssuspensionforfourtimes,granulationtissuegrewrapidlytofulfillthesinustractandbecameepithelized.Twelvedaysaftertreatment,thefracturewashealed.ItindicatesthatUCMSCshaveself-renewalandpluripotentdifferentiationpotentialandcandifferentiateintoosteoblastsinvitro.Fortreatmentofbonenonunion,UCMSCshastheabilitytoimprovemicroenvironment.LiHT,BianLF,WuSG,LiQ,WangLL,DaiYC,LiuY. Invitroexperimentofumbilicalcordmesenchymalstemcellstopromotebonehealingandclinicalapplicationinonecase.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu.2011;15(45):8542-8546. []摘要背景：華通膠來源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞比成人間充質(zhì)干細(xì)胞更原始，研究表明其端粒酶活性更高、培養(yǎng)倍增時(shí)間更短、分化的細(xì)胞譜系更廣。目的：觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分化為成骨細(xì)胞的能力及治療骨折不愈合的效果。方法：從臍帶Wharton膠獲取細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增，取傳代細(xì)胞行免疫表型測定和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并以臍帶間充質(zhì)細(xì)胞移植Correspondenceto:DaiYu-cheng,Researcher,MolecularMedicineCenterofSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversityMedicalSchool,Nanchang330000,JiangxiProvince,ChinaReceived:2011-08-03Accepted:2011-09-10

治療1例骨折感染外露后長期不愈病例。結(jié)果與結(jié)論：培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)類成纖維細(xì)胞，可長期穩(wěn)定培養(yǎng)，傳代細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型，成骨誘導(dǎo)分化的細(xì)胞茜素紅染色胞漿中有大量的鈣沉積，VonKossa染色有鈣結(jié)節(jié)形成?；颊卟捎媚殠чg充質(zhì)干細(xì)胞混懸液外用4次，肉芽組織迅速增生填滿竇道并上皮化，12d創(chuàng)面愈合。說明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度自我更新能力和分化潛能，能夠向成骨細(xì)胞分化，將其移植治療骨不連可以顯著改善局部微環(huán)境。關(guān)鍵詞：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；成骨細(xì)胞分化；骨折外露；骨愈合doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.45.041李華濤，邊琳芬，吳勝剛，李強(qiáng)，王黎麗，戴育成，劉洋.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨愈合的體外實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用1例[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(45):8542-8546.[]的細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨供者年齡的增大0引言而下降，病毒感染率較高[4]，且供者BMSCs采集須行骨髓穿刺術(shù)，來源受到限制。臍血MSCs間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，的生物學(xué)特征與BMSCs相似，但臍血中MSCs)是中胚層來源的一類具有高度自我更新BMSCs含量少，分離效率低限制了它在組織工和多向分化能力的干細(xì)胞，其來源豐富，主要程和細(xì)胞治療中的應(yīng)用[5-6]。有骨髓、臍血、臍帶、脂肪、全身結(jié)締組織和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcord[1]mesenchymalstemcells，UCMSCs)是指存在器官間質(zhì)。目前骨髓是實(shí)驗(yàn)和臨床研究中MSCs的主要來源，實(shí)驗(yàn)表明骨髓MSCs(bone于臍帶華通膠(Wharton'sjelly)、血管及其周圍marrowmesenchymalstemcells，BMSCs)在組織中的多能干細(xì)胞，易于分離培養(yǎng)，病毒感不同誘導(dǎo)條件或機(jī)體受傷情況下能夠分化成等染機(jī)會(huì)小，具有與BMSCs基本相同的免疫表型多種組織細(xì)胞，從而有可能為組織修復(fù)提供細(xì)和多向分化潛能，而且UCMSCs的增殖能力更胞材料，臨床上已有成功治療骨不連、慢性難[7-8]強(qiáng)、免疫原性更低。異源MSCs具有避免疫愈創(chuàng)面等方面的病例報(bào)告[2-3]。但成人BMSCs識別、抑制免疫反應(yīng)的特性，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果8542 P.O.Box1200,Shenyang 110004 cn.zglckf.co m李華濤，等. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨愈合的體外實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用表明同種異基因 MSCs的應(yīng)用是安全可行的 [9]。由此可見，UCMSCs是更理想的細(xì)胞治療的種子細(xì)胞。而且臍帶容易獲取，對供受者無不利影響，有望替代自體骨髓成為 MSCs的重要來源。目前已有較多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)UCMSCs移植治療腦、脊髓、心、肺等組織器官的損傷與病變以及糖尿病、毛囊重建等方面取得了滿意的療[10-14]效，但相應(yīng)的臨床應(yīng)用很少。文章觀察到UCMSCs在體外可定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，嘗試性以UCMSCs移植治療1例骨折外露長期不愈病例取得了滿意療效。對象和方法設(shè)計(jì)：病例報(bào)告。時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2008-09/2009-10在解放軍第八九醫(yī)院完成。材料：試劑及儀器：試劑及儀器來源膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、DMEM\F-12Gibco“BASE”甲基纖維素培養(yǎng)基Stemcell小鼠抗人PE標(biāo)記CD44、CD34、PharMingenCD31、CD73、CD90、CD29和FITC標(biāo)記的CD105、CD45抗體以及相應(yīng)同型同照-86℃超低溫冰箱、CRYO400液THERMO氮保存系統(tǒng)BX-51系統(tǒng)顯微鏡、CKX41SF-32Olympus型倒置顯微鏡流式細(xì)胞儀Beckman

1例UCMSCs的免疫表型鑒定及向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化：免疫表型鑒定：收集培養(yǎng)的 P3代、P5代、P10代細(xì)胞以 PE標(biāo)記的CD44、CD34、CD31、CD73、CD90、CD29，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD105、CD45 抗體及其相應(yīng)同型對 照標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化：取P3代MSC在傳4/cm2的密度接種于24孔板中代的同時(shí)以2×108mm×8mm玻片上，每孔加入體積分?jǐn)?shù)15%FBS，1μg/L堿性成纖維細(xì)胞的低糖DMEM培養(yǎng)液0.8mL；待細(xì)胞達(dá)80%融合，換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%FBS，1nmol/L地塞米松，50mmol/L維生素C，10mmol/L甘油磷酸鈉)，以后每三四天換1次液；3周后進(jìn)行茜素紅染色和VonKossa染色，檢測鈣化基質(zhì)沉淀。病歷介紹：病史：患者男，45歲。因左前臂機(jī)器軋燙傷疼痛0.5h于2008-09-24入解放軍第八九醫(yī)院燒傷整形科，左前臂中遠(yuǎn)段背側(cè)及腕掌側(cè)見黃白色焦痂創(chuàng)面，腫脹明顯，左手皮膚蒼白發(fā)涼、感覺減退，見圖1。

CRTER.org解放軍第九八醫(yī)院燒傷整形科，浙江省湖州市313000；2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，江西省南昌市330000；協(xié)和華東干細(xì)胞基因工程有限公司，浙江省湖州市313000李華濤☆，男，1970年生，江西省廣豐縣人，漢族，2000年解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)畢業(yè)，博士，副主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)面修復(fù)方面的研究。通訊作者：戴育成，研究員，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，江西省南昌市330000中圖分類號:R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B文章編號:1673-8225(2011)45-08542-05收稿日期：2011-08-03修回日期：2011-09-10(20110803014/W·C)UCMSCs的分離、擴(kuò)增及細(xì)胞懸液制備：健康足月順產(chǎn)胎兒臍帶組織(產(chǎn)婦知情同意)在無菌條件下以0.1mol/LPBS液反復(fù)沖洗去除污血。分段剝離臍帶外膜、臍靜脈、臍動(dòng)脈，取出Wharton膠，將其剪碎成1mm×1mm×1mm小塊，經(jīng)1g/LⅡ型膠原酶37℃消化1h。過濾消化液，1倍稀釋后，1500r/min離心5min收集細(xì)胞，接種于10%胎牛血清的DMEM\F-12培養(yǎng)液。接種后24h全量換液，其后每三四天半量換液。細(xì)胞達(dá)70%匯合后，以2.5g/L胰酶+0.01%EDTA消化并按1∶2~1∶3傳代。取P3~6代UC-MSC，2.5g/L胰酶+0.01%EDTA消化后，DMEM/F12離心洗滌2遍。用DMEM/F129-1將UC-MSC制備成1×10L細(xì)胞濃度細(xì)胞懸液，與“BASE”甲基纖維素以1∶混勻，4℃恒溫保存待用。

Figure1 Heatcrushedoftheleftforearm:extensorgroupwasdamagedwithradialfracture圖1 左前臂熱壓傷：伸肌群毀損伴橈骨骨折X射線片示左橈骨遠(yuǎn)1/3處骨折，對位對線好。入院后急行焦痂切開減張，手部血運(yùn)改善。傷后2h全麻下行清創(chuàng)，見前臂背側(cè)中遠(yuǎn)段的伸指肌群大塊壞死，清除后長段尺橈骨暴露；腕部見屈腕、屈指肌腱部分壞死，橈動(dòng)脈管壁發(fā)黑、搏動(dòng)弱，有栓塞征象。遂以左上腹帶蒂皮瓣轉(zhuǎn)移覆蓋前臂背側(cè)創(chuàng)面，腕部創(chuàng)面貼于供瓣區(qū)深筋膜表面，皮緣縫合固定包埋創(chuàng)面。術(shù)后17d，腕部創(chuàng)面突發(fā)大量出血，急診探查發(fā)現(xiàn)尺動(dòng)脈破裂出血，橈動(dòng)脈已栓塞，行腹部皮瓣斷蒂以修復(fù)前臂背側(cè)創(chuàng)面，切取左小腿大隱靜脈橋接腕部尺動(dòng)脈以恢復(fù)左手動(dòng)脈血供，設(shè)計(jì)右上腹帶蒂皮瓣覆蓋左腕創(chuàng)面，16d后行斷蒂術(shù)，左腕創(chuàng)面封閉，左手血循環(huán)良好，見圖2。ISSN1673-8225CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 8543www.CRTER.org 李華濤，等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨愈合的體外實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用 1例后6個(gè)月時(shí)，骨折外露竇道以UCMSCs懸液移植填充。具體方法：0.1%新潔爾滅液、生理鹽水沖洗創(chuàng)面及周圍9-1UCMSCs細(xì)胞懸液1mL皮膚，無菌條件下將1×10L滴入竇道并填滿創(chuàng)腔，生理鹽水紗布覆蓋，外以數(shù)層無菌紗布包扎，兩三日重復(fù)治療1次直至創(chuàng)面愈合。2結(jié)果Figure2Imageafterflapprosthesis圖2皮瓣修復(fù)術(shù)后2.1UCMSCs的培養(yǎng)、鑒定和向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)術(shù)后左上肢行石膏托外固定，創(chuàng)面痊愈出院。出院果原代細(xì)胞多于24h內(nèi)貼壁，四五天融合70%，以成后復(fù)查X射線片示骨折線清晰、對位好、無明顯骨痂生纖維樣細(xì)胞為主，呈漩渦狀生長，傳至第3代后，成為長。傷后62d，患者左前臂背側(cè)皮瓣切口處潰破，少許形態(tài)較均一的長梭形細(xì)胞，仍呈漩渦狀生長，見圖5，膿液溢出，探針示來源于骨折端，X射線片示骨折線增連續(xù)傳10代，細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志無明顯改變。P3代、寬、有游離骨片。經(jīng)切開竇道、摘除碎骨片，加強(qiáng)換藥P5代、P10代所培養(yǎng)貼壁細(xì)胞均表達(dá)CD105、CD44、后感染消除，但骨折端軟組織附著少，肉芽組織難以長CD73、CD90和CD29，不表達(dá)造血細(xì)胞表型CD34、入?；颊邚?qiáng)烈要求保守治療，故創(chuàng)面先后予常規(guī)換藥(外CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表型CD31。茜素紅染色胞漿中有大量用康復(fù)新液、堿性成纖維細(xì)胞等促愈合藥物)及封閉負(fù)壓的鈣沉積，VonKossa染色有鈣結(jié)節(jié)形成，見圖6，7。引流治療50d，骨外露處仍無肉芽組織生長。X射線片報(bào)告為骨折斷端密度增高，骨痂生長不明顯，擬診骨不連。遂再次手術(shù)清創(chuàng)至骨質(zhì)斷面有較明顯滲血，骨折端骨缺損較多呈碟形，僅深面有1/3管周徑骨折端對合(對合面有輕度階梯差)，見圖3，術(shù)后繼續(xù)常規(guī)換藥及封閉負(fù)壓引流治療42d，創(chuàng)面明顯縮小形成竇道，見圖4，但基底始終有8mm×10mm骨折端暴露。Figure5 Vortex-likegrowthofumbilicalcordmesenchymalstemcells(×100)圖5旋渦狀生長的UCMSCs(×100)Figure3 Phialiformbonedefectsonthesideoffracture,nogrowthofcallus圖3 骨折端碟形骨缺損，未見骨痂生長Figure6 Calciumdepositionincytoplasmdetectedbyalizarinredstaining(×100)圖6茜素紅染色見胞漿中鈣沉積(×100)Figure4 Sinustractoutofthefractureside圖4 骨折端外露竇道查體：X射線片示骨折斷端骨缺損、骨折線仍清晰、骨痂生長不明顯。診斷：骨折外露長期不愈。干預(yù)：經(jīng)患者知情同意及醫(yī)院 倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，傷

Figure7 Calciumnodules formationdetectedbyVonKossastaining( ×100)圖7Von Kossa染色見鈣結(jié)節(jié)形成(×100)8544 P.O.Box1200,Shenyang 110004 [19-20]李華濤，等. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨愈合的體外實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用 1例 www.CRTER.org2.2 患者創(chuàng)面及骨折愈合情況 UCMSCs混懸液外用4次，肉芽組織迅速增生填滿竇道并上皮化，12d創(chuàng)面愈合，見圖8。Figure8 Healingofthesinustract圖8竇道愈合出院后每月復(fù)查X射線片示骨折端骨痂開始大量生長、骨折線漸模糊。傷后1年再次入院行皮瓣修薄術(shù)，見局部皮膚穩(wěn)定無潰破，見圖9，骨折已愈并重塑，見圖10。Figure9 Imageafterflapprosthesis圖9 皮瓣修薄術(shù)后Figure10 Fracturehealingandremodelingoftheradius圖10 橈骨骨折愈合并重塑2.3不良反應(yīng)患者應(yīng)用UCMSCs治療后，未出現(xiàn)免疫、過敏及不適等全身或局部反應(yīng)。討論骨折的愈合包括4個(gè)連續(xù)的過程：細(xì)胞募集、骨誘導(dǎo)、骨調(diào)控和骨傳導(dǎo)。發(fā)生骨折后，鄰近及全身的成骨性干細(xì)胞募集于骨折處，骨折局部骨形態(tài)發(fā)生蛋白等骨生長因子分泌增多，誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，出現(xiàn)骨的再生，進(jìn)而依據(jù)wolff定律，進(jìn)行骨的改建與塑型。

骨折局部條件是影響骨折愈合的主要因素，血供破壞、骨折端間距過大、骨缺損、軟組織嵌入等因素都會(huì)導(dǎo)致骨折延遲愈合甚至不愈合。分析本例患者橈骨骨折愈合情況的病程進(jìn)展，可以看出雖然骨折處創(chuàng)面在傷后當(dāng)日即得到有效覆蓋，但傷后2個(gè)月，在尚未發(fā)生感染前，骨折處仍未見骨痂生長跡象，原因是創(chuàng)傷破壞了骨周軟組織及骨膜，包括骨的滋養(yǎng)血管，造成骨折端壞死。因患者出院后未能堅(jiān)持石膏外固定，骨折斷端有輕微活動(dòng)致局部出血、積液，進(jìn)而引發(fā)感染。在清除感染灶并徹底去除死骨后，雖經(jīng)封閉負(fù)壓引流等促愈治療，骨折端骨痂新生不明顯，則不僅與血供破壞有關(guān)，骨折端骨缺損過多、成骨細(xì)胞稀少且活力不足也是一個(gè)重要因素，提示需要在局部補(bǔ)充具有成骨能力的種子細(xì)胞。自體松質(zhì)骨或帶血管蒂骨瓣移植是治療骨延遲愈合的主要手段，可以提供骨修復(fù)所需的基本元素。但對于此病例，因局部軟組織條件差且無適合的受區(qū)血管限制了上述手術(shù)的實(shí)施；再者，患者前臂伸指肌群大塊毀損、腕部屈指肌腱廣泛粘連，從恢復(fù)肢體功能角度考慮進(jìn)行植骨治療也無實(shí)際意義。因此，以UCMSCs治療此類損傷是一種有益的臨床嘗試。干細(xì)胞不 僅可以增殖分化為修復(fù)細(xì)胞 直接參與損傷組織的重建，還可作為調(diào)節(jié)性功能細(xì)胞以旁分泌形式分泌大量生物活性分子，促進(jìn)其他修復(fù)細(xì)胞的功能。Mackenzie等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，移植的MSCs具有向病變[15]部位遷移并分化成機(jī)體所需要的相應(yīng)細(xì)胞的能力 。研究顯示BMSCs單獨(dú)注射或與載體材料復(fù)合移植可修復(fù)長段骨缺損或骨不連，新生骨痂量與移植干細(xì)胞濃度、[2,16-17]經(jīng)體外數(shù)量呈正相關(guān)。UCMSCs具有成骨潛能，擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量后，是理想的骨修復(fù)種子細(xì)胞[18]。同時(shí)，MSCs能顯著改善組織的血供，如BMSCs注射到缺血組織內(nèi)或燒傷創(chuàng)面下，能明顯促進(jìn)新生血管形成，增加肉芽組織中的血管 密度 。同文獻(xiàn)報(bào)道一致。華通膠來源 UCMSCs比成人間充質(zhì)干細(xì)胞更原 始，研究表明其端粒酶活性更高、培養(yǎng)倍增時(shí)間更短、分化的細(xì)胞譜系更廣(微點(diǎn)陣分析示表達(dá)三胚層來源細(xì)胞標(biāo)志)。本病例存在著骨折端骨質(zhì)缺損、斷面直接暴露、創(chuàng)面內(nèi)軟硬組織血運(yùn)不佳等問題，分析創(chuàng)面修復(fù)缺乏適宜的微環(huán)境、各類修復(fù)細(xì)胞數(shù)量及活力也明顯不足，雖經(jīng)清創(chuàng)、外用多種生長因子、 封閉負(fù)壓吸引進(jìn)等治療6個(gè)月余，創(chuàng)面和骨折仍遷延不愈。結(jié)合文獻(xiàn)資料和本文臨床觀察提示UCMSCs移植可能通過多因素協(xié)同作用促進(jìn)創(chuàng)面和骨折的愈合，即：創(chuàng)面作為刺激源與UCMSCs交互作用，后者分化為所需的相應(yīng)細(xì)胞參與受損組織的修復(fù)，部分信號傳導(dǎo)通路被激活而分泌細(xì)胞因子、誘導(dǎo)微血管生成、改善缺血組織微環(huán)境，也激活了機(jī)體自身修復(fù)細(xì)胞的功能，從而使創(chuàng)面迅速封閉。同時(shí)，UCMSCsISSN1673-8225CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 8545CRTER.org是一類免疫特許細(xì)胞，可在體內(nèi)長期存活，持續(xù)補(bǔ)充“外援性”種子細(xì)胞參與并促進(jìn)了骨折的愈合。參考文獻(xiàn)

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