SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選霉變煙葉特異性標志蛋白

.z目錄摘要2前言2l材料與方法41.1樣品采集41.2儀器與試劑41.3試劑的配制4電泳緩沖液的配制4樣品緩沖液制備4考馬斯亮藍R-250固定液的配制4考馬斯亮藍R-250染液的配制4考馬斯亮藍脫色液的配置41.4煙葉蛋白的提取41.5聚丙烯酰胺凝膠電泳41.6考馬斯亮藍染色52結果與討論53展望6致謝7參考文獻7SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選霉變煙葉特異性標志蛋白摘要：為了找出霉變煙葉里的特異性標記，我們采集了75個霉變煙葉樣品，以及11個正常煙葉樣品作為對照。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以檢測和分析出不同的蛋白帶型。正常煙葉的特異性標志蛋白已經(jīng)被鑒定出來〔相對分子質(zhì)量大約為20Da〕。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選霉變煙葉里的特異性標志蛋白，找出了霉變煙葉和正常煙葉里的蛋白質(zhì)指紋差異，為建立快速、準確的煙葉霉變檢測方法提供了先決條件。關鍵詞：霉變煙葉；蛋白指紋；SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳ScreenforSpecificBiomarkerinMoldedFlue-CuredTobaccoLeavesbySDS-PolyacrylamideGelElectrophoresisAbstract:Toscreenrelativelyspecificallymarkersinmoldedflue-curedtobaccoleaves(FCTL),75samplesofmoldedFCTLwerecollectedandanadditional11samplesofunmoldedFCTLwereusedascontrols.TheproteinprofilesweredetectedandanalyzedbySDS-polyacrylamidegelelectrophoresis.AFCTL-specificbiomarker(relativemolecularweightis20Da)wasidentified.ThepatternofthemarkerprovidesapowerfulandreliablediagnosticmethodformoldedFCTLwithhighsensitivityandspecificity.Keywords:Moldedflue-curedtobaccoleaves;Fingerprints;SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis前言煙草是以收獲葉片為主的重要經(jīng)濟作物，煙葉的自然醇化或人工發(fā)酵是提高煙葉燃吸品質(zhì)和可用性的重要環(huán)節(jié)之一。煙葉自然醇化貯藏周期長，由于煙葉吸濕性強，而煙葉中又含有微生物生長所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，一旦條件適宜，煙葉在貯藏過程中極易滋生各種微生物而發(fā)生霉變。中國煙草倉儲面積達700萬m2。在煙葉倉儲損耗中，煙葉霉變造成的損失十分嚴重，影響煙葉的外觀品質(zhì)和香味品質(zhì)，降低煙葉的使用價值，尤其南方煙區(qū)煙葉霉變甚至成為影響企業(yè)經(jīng)濟效益的重要因素［1］。除了經(jīng)濟上的需要外，還有另一個重要原因，那就是：煙葉的微生物污染應被控制在最少量［4］。眾所周知，許多真菌毒素對人體有毒性，如黃曲霉素，是目前發(fā)現(xiàn)最強的化學致癌物質(zhì)，同時具有致畸和致突變作用，而這類真菌又往往是誘發(fā)煙葉霉變的生物因子。微生物分解利用煙葉中蛋白質(zhì)時，先分泌蛋白酶到細胞外，將蛋白質(zhì)水解成為短肽后再透入細胞，細胞內(nèi)的肽酶進而將肽水解成氨基酸。在霉變煙葉中，會出現(xiàn)煙葉的蛋白質(zhì)氮減少，而非蛋白質(zhì)氮增加的現(xiàn)象，在通常情況下，霉變煙葉的總氮不會減少，有時反而會增加，這主要是由于微生物大量繁殖所形成的物質(zhì)轉(zhuǎn)化的結果［2］。氨基酸除可直接用于微生物自身新蛋白質(zhì)的合成外，不同的微生物在相應的酶系催化下，也可通過脫氨基作用和脫羧基作用進一步分解，生成很多代謝產(chǎn)物，影響煙葉的品質(zhì)。如氨、硫化氫、吲哚和類臭素等物質(zhì)可使霉變的煙葉腐敗發(fā)臭；由于產(chǎn)生的有機酸的積累，可使煙葉酸度增高；微生物分解氨基酸的另一些產(chǎn)物，如硫醇類等黃色物質(zhì)，能使煙葉發(fā)褐變色，促進褐變反響，使煙葉失去原有色澤；二元氨基酸經(jīng)脫羧后，能生成二元胺，如腐胺、尸胺、精胺以及色胺、酪胺和組胺等，不僅使煙葉發(fā)出惡臭，還會使煙葉及其制品帶毒，嚴重影響食用衛(wèi)生［4］。在煙葉儲藏中，可以根據(jù)煙葉霉變的生物化學和微生物學原理，判斷煙葉的穩(wěn)定性，評價煙葉品質(zhì)，及時設計對策，控制煙葉環(huán)境，抑制微生物在糧食上的代謝活動，有效地保護煙葉平安。隨著吸煙與**問題越來越受到人們的重視，防止煙葉霉變將成為卷煙生產(chǎn)上必須解決的重要課題[2]。經(jīng)過研究，造成煙葉霉變的原因有很多，有內(nèi)因，也有外因概括起來主要有以下幾點：①病原微生物的影響①煙葉含有適宜微生生長物的營養(yǎng)物質(zhì)②溫度與濕度的影響③煙葉成熟度和包裝材料的影響［14］。微生物在煙葉及其制品上活動危害時，并不能直接吸收煙葉中的各種復雜的營養(yǎng)物質(zhì)，必須依靠其分泌的胞外酶，在細胞外將煙葉中大分子物質(zhì)(淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和脂肪等)水解為可溶性的低分子物質(zhì)，才能吸收到細胞內(nèi)加以利用，這是微生物進展營養(yǎng)的根本特點［4］。所以，煙葉霉變過程，就是微生物分解和利用煙葉中有機物質(zhì)的生物化學過程，實質(zhì)上就是微生物以煙葉為營養(yǎng)基質(zhì)，進展消化、吸收和利用的營養(yǎng)過程，這個過程包括了微生物進展物質(zhì)代謝和能量代謝的生物化學反響［3］。微生物的物質(zhì)代謝，包括分解代謝和合成代謝兩個方面。前者是微生物將煙葉中復雜的有機物質(zhì)，先在細胞外分解為低分子化合物，然后吸收，再在細胞內(nèi)氧化分解，獲得營養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和釋放能量的過程；后者則是微生物利用儲存能量，以低分子的中間代謝物質(zhì)為原料，合成新的細胞物質(zhì)的過程。因此，微生物在煙葉上的代謝活動，保證了微生物自身的生長、發(fā)育和大量繁殖，其結果反映在煙葉上，便是霉變的發(fā)生和開展。由此可見，煙葉霉變的生物學根底是微生物與環(huán)境所進展的物質(zhì)交換和能量轉(zhuǎn)化［10］。生物功能的主要表達者是蛋白質(zhì)，復雜的基因間和蛋白質(zhì)的相互作用，細胞內(nèi)的活動和黃靜影響都會影響基因的表達及蛋白質(zhì)的翻譯后加工［8］。蛋白質(zhì)作為一個空間和時間上動態(tài)的整體，各個蛋白質(zhì)之間的相互作用，**而有序地連接在一起，形成多個子系統(tǒng)，實現(xiàn)特定的生理功能［5］。從基因水平到蛋白質(zhì)水平的深化，已成為生命科學研究的迫切需要和新的任務。利用電泳技術檢測植物蛋白質(zhì)的異質(zhì)性,并以此作為分類、進化和遺傳研究的依據(jù),早已得到廣泛的應用［7，15］。蛋白質(zhì)作為基因的直接穩(wěn)定產(chǎn)物,能反映生物組成上的差異。因此我們想到通過篩選霉變煙葉異性標志蛋白，可以為建立煙葉霉變檢測方法奠定根底[9]。本文利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法來篩選霉變煙葉異性標志蛋白。l材料與方法1.1樣品采集倉儲霉變煙葉75個和正常煙葉11個由**卷煙廠提供。1.2儀器與試劑DYY-10型電泳儀，SIGMA13高速離心機，奧豪斯2140電子天平，脫色搖床，瓊脂糖，40%丙烯酰胺，甘油，Tris-Cl，SDS，過硫酸銨，TEMED，正丁醇，溴芬蘭，考馬斯亮藍R-250，冰醋酸，甲醇，亞甲雙丙烯酰胺，蒸餾水.1.3試劑的配制電泳緩沖液的配制：Tris堿3g，甘氨酸14.4g，SDS1g，加蒸餾水至1L，pH8.3，冰箱里備用.樣品緩沖液制備：1mol/LTris-HCl0.6ml，參加50%甘油5ml，10%SDS2ml，2巰基-乙醇0.5ml，1%溴芬蘭1ml，蒸餾水0.9ml，4℃冰箱中存放備用.考馬斯亮藍R-250固定液的配制：取400ml乙醇、100ml冰醋酸、500ml水.考馬斯亮藍R-250染液的配制：取0.04g考馬斯亮藍R-250，甲醇18ml，蒸餾水18ml，冰醋酸4ml.考馬斯亮藍脫色液的配置：取400ml甲醇、100ml冰醋酸、500ml水.1.4煙葉蛋白的提取將混合后的正常煙葉和霉變煙用液氮充分研磨，各稱取50mg，參加200ul樣品緩沖液后置于Eppendoff管中，沸水浴中保溫10min,10000r/min離心10min，所得上清即是樣品蛋白，-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?.5聚丙烯酰胺凝膠電泳將電泳槽玻璃板洗凈烘干，然后放于膠條凹槽中，后固定到電泳槽夾板中，將低的玻璃板面向黑色負極，按對角線上緊螺絲。將通電泳緩沖液的孔用乳膠塞塞上，取冷卻未凝的0.8%瓊脂糖液70ml倒于玻板和電泳槽的兩個電緩槽中，靠近負極的的一側(cè)加40ml左右，室溫冷凝，保證將玻板封嚴而不漏膠。取40%丙烯酰胺5.00ml，pH8.8的4*Tris'cl/SDS5.00ml,H2O10.0ml，10%過硫酸銨70μl，TEMED15μl濃度的別離膠。用注射器將別離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣參加玻璃板夾層中，至離低玻板3cm處。用另一注射器順著玻璃頂部緩慢參加正丁醇2cm高。室溫聚合30~60min。傾去正丁醇，并以1*Tris'cl/SDS,pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部外表。用濾紙吸干外表水分。按順序配積層膠〔4%濃度〕：混勻0.65ml30%丙烯酰胺/0.8%亞甲雙丙烯酰胺溶液，1.25mlpH6.8的4*tris-Cl/SDS緩沖液和3.05ml水，真空下脫氣10~15min，參加25μl10%過硫酸銨和5μlTEMED,搖勻，立即使用，注射器加到離頂部5mm處將厚度與夾層厚度一致的梳子插入其中，補充剩余空隙，室溫凝30~45min。在1.5ml離心管中處理蛋白質(zhì)，處理MarK方法：100℃沸水5分鐘，冰浴5分鐘，13000rpm離心兩分鐘。其他蛋白處理方法：100℃待膠凝后，向電泳槽中倒1*SDS電泳緩沖液，一邊沒過低玻璃斑上沿，一邊沒過泳槽一半的金屬絲，浸泡幾分鐘后小心拔出梳子，用注射器吹洗膠孔幾次，通低電壓幾分鐘后斷電。、用槍參加樣品蛋白5μl，恒壓電泳，積層膠用85V，當溴芬蘭指示劑過了別離膠界面時電壓調(diào)為150V。耗時3~4.5h。將冷凝管接好通水保持膠的穩(wěn)定，當溴芬蘭至膠低0.5cm處關電源，撤導線和水管，棄去電泳緩沖液，將電泳夾層取出。標記凝膠，用刀片將凝膠與玻璃邊沿處劃一兩次，保護膠的脫離。1.6考馬斯亮藍染色1.6.11.6.2凝膠在染色液中搖蕩過夜1.6.3膠在脫色液中搖蕩過夜消除背景用洗脫液洗脫至背景無色后,用掃描儀采集電泳圖.2結果與討論微生物在煙葉及其制品上活動危害時，并不能直接吸收煙葉中的各種復雜的營養(yǎng)物質(zhì)，必須依靠其分泌的胞外酶，在細胞外將煙葉中大分子物質(zhì)(淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和脂肪等)水解為可溶性的低分子物質(zhì)，才能吸收到細胞內(nèi)加以利用，這是微生物進展營養(yǎng)的根本特點。一般情況下的霉變煙葉中，會出現(xiàn)煙葉的蛋白質(zhì)氮減少，而非蛋白質(zhì)氮增加的現(xiàn)象。本試驗中霉變煙葉里出現(xiàn)的特異性蛋白，很可能是大量繁殖的微生物的自身蛋白。微生物在煙葉上的代謝活動，保證了微生物自身的生長、發(fā)育和大量繁殖，其結果反映在煙葉上，便是霉變的發(fā)生和開展。圖1聚丙烯酰胺凝膠電泳結果120(kda)8647342620①②③正常煙葉④⑤⑥⑦霉變煙葉由圖1可知,霉變煙葉中出現(xiàn)了蛋白分子量約為20kda的蛋白條帶，而在正常煙葉中則沒有出現(xiàn)這樣的特異蛋白。因此我們可以通過進一步篩選霉變煙葉異性標志蛋白，檢測引起煙葉霉變的微生物類群。此外,霉變和正常這兩種不同樣品間的蛋白除一段差異蛋白點外,在87kda~120kda附近有相似蛋白系列，為煙葉本身的蛋白組系列。通過總蛋白一維電泳指紋圖譜分析完全可以區(qū)分霉變和正常煙葉，對于差異性蛋白點和相匹配蛋白點可以給出明確的判定。3展望蛋白質(zhì)氨基酸鑒定上的應用已經(jīng)應用于中醫(yī)藥界藥品的檢驗,疾病的快速檢驗，食物過敏原的快速檢測、分析和鑒定等等,結果證明以聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)指紋圖譜鑒定不同試驗樣品的總蛋白確實可行,而且檢測分析結果在不同實驗儀器和耗材之間具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,這對建立快速、準確的煙葉霉變檢測方法提供了良好的根底。我們有理由相信，利用篩選霉變煙葉特異性標志蛋白，很有可能夠找到快速、準確的煙葉霉變檢測方法。接下來，我們要探討更進一步地別離純化蛋白質(zhì)，用更準確的蛋白質(zhì)別離技術別離霉變煙葉中的蛋白質(zhì)，比照微生物的蛋白圖譜，從而找出霉變煙葉中微生物中的類型。致謝在畢業(yè)論文過程當中，我得到了很多教師和同學的關心和幫助。在此論文完成之際，我要向他們表示我最真誠的謝意。首先我要感謝我的指導老師李文鵬教師。感謝李教師讓我承擔這個研究課題，并在實驗中給與我悉心的指導和支持，教給我科研的方法，在實驗過后悉心指導畢業(yè)論文的寫作。正是在李教師的幫助下我才能順利完成畢業(yè)論文。我要感謝周海軍、王建雄、李金龍和*曉川同學，他們在實驗中給我很大的幫助和啟發(fā)。感謝同宿舍同學在我實驗不順利時給我的支持和鼓勵。論文的完成和他們也是分不開的，在此我向他們一并表示最衷心的感謝！參考文獻:[1]黃福新,周興華,朱桂寧,晏衛(wèi)紅,等.**煙倉霉變發(fā)生狀況調(diào)查及主要霉變因素[J].2007，4：411~414[2]連賓,煙葉霉變及防治[J].**科學．1998，6：124~127.[3]周建新,論糧食霉變中的生物化學，**經(jīng)濟學院食品科學與工程系.2004：19~11.[4]李梅云,高家合,王革,微生物對煙葉蛋白質(zhì)含量的影響[J].生物技術通報，2006.增刊：376~380[5]吳海強,余曉,*志剛,食品過敏原指紋圖譜快速檢測研究[J].熱帶醫(yī)學雜志，2006,02：131~134[6]吳莉莉,林愛英,*寶周,電子鼻檢測技術在糧食霉變識別中的應用研究[J].**農(nóng)業(yè)科學，2009,37(21