金華市淡色庫蚊對殺蟲劑的抗性基因提取分析,昆蟲學論文

PAGEPAGE6金華市淡色庫蚊對殺蟲劑的抗性基因提取分析,昆蟲學論文為探究導致金華市淡色庫蚊抗性變化的分子機制,利用PCR技術對金華市淡色庫蚊相關抗性基因進行檢測.本研究綜合已報道淡色庫蚊抗性基因文獻和序列等信息,利用生物信息學手段,設計合適抗性基因引物,并利用該引物獲得高質量的目的基因片段.共對乙酰膽堿酯酶(ace1),P450超家族(cyp6f1),非特異性酯酶(Est-2),鈉離子通道(vssc),糖原分支酶(NYD-GBE),肌球蛋白(NYD-MLC2)等6類基因進行了PCR擴增.1材料與方式方法1.1供試昆蟲淡色庫蚊金華現場品系1.2試劑UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0(大連TaKaRa公司,生產批號:CA1201)、DNAMarkerDL2000(大連TaKaRa公司,生產批號:B2701A)、ExTaqDNA聚合酶(大連TaKaRa公司,生產批號:CKA270113).1.3儀器梯度PCR儀(美國Bio-rad公司,型號PTC-1148),低溫高速離心機(美國ThermoMicro公司,型號17R),電泳儀(美國Bio-rad公司,型號PowrPacBasic)等.1.4引物設計與合成根據已報道文獻以及抗藥性相關基因序列[1-4],采用VerctorNTI進行序列比對,選取保守序列區(qū)進行引物設計,擴增片段應基本涵蓋已報道的常見基因突變點,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1).1.5方式方法1.5.1模板提取現場品系以及敏感品系第1代、第2代4齡幼蟲各取20只,分別勻漿混勻,按Univer-salGenomicDNAExtractionKit方式方法提取DNA.總DNA提取后,進行瓊脂糖凝膠電泳做定性鑒定,保存于-70℃冰箱備用.1.5.2PCR反響體系10PCR緩沖液(含Mg2+)2l,dNTPs(2.5mmol/L)0.4l,TaqDNA聚合酶(5U/l)0.25l,引物(20mol/L)各1l,模板DNA2l,雙蒸水補足至20l.1.5.3反響程序94℃5min;94℃0.5min;50℃~60℃0.5min(不同引物進行相應調整),72℃1min,35個循環(huán);72℃5min.1.5.4PCR產物的檢測1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外觀察擴增結果.1.5.5測序PCR產物序列測定由上海生工、大連寶生物公司完成.測得序列,利用軟件Chromas對照相應峰圖進行校對.校對后新序列上傳Genbank數據庫,Accessionnumbers:HQ540599,HQ540604,HQ540609,HQ540622,HQ540627,HQ540632.2結果2.1PCR擴增利用本課題設計的引物,經PCR擴增條件優(yōu)化,均擴增到特異目的片段,見圖1.擴增片段豐度高,且無非特異性雜帶和拖尾現象,可用于測序分析.2.2抗性相關基因序列分析金華現場品系與敏感品系抗性相關基因序列利用Vector序列分析軟件進行比對分析.華而不實vssc基因序列差異較大,序列類似度僅有84.1%,但差異序列主要集中在內含子區(qū),外顯子序列完全一樣;非特異性酯酶Est-2基因現場品系與敏感品系存在4個核苷酸的差異;ace1基因序列現場品系與敏感品系存在2個核苷酸的差異;P450超家族cyp6f1基因序列現場品系與敏感品系存在1個核苷酸的差異;NYD-GBE、NYD-MLC2基因序列現場品系與敏感品系無差異,類似度為100%.見圖2.2.3氨基酸序列分析為了進一步了解抗性相關基因序列點突變對金華淡色庫蚊現場品系抗性表型的影響,我們利用軟件VerctorNTI軟件將發(fā)生點突變的序列翻譯成氨基酸序列,進行比對.結果顯示,ace1基因、cyp6f1基因、Est-2基因的點突變均為無意突變,不會導致氨基酸序列變化.3討論高質量的基因片段的克隆是獲得好的序列分析結果的基礎和重要前提.用于序列測定的PCR產物一般要求特異度高,不能存在非特異性擴增片段或拖尾現象等.另外,目的片段產量要高,以提高信噪比或提高克隆測序時的轉化成功率.國內外關于庫蚊抗性基因擴增的文獻報道固然較多,但檢測方式方法較為混亂[5-8],所以很難直接用于本課題研究.因而本課題在已有文獻的基礎上,利用生物信息學技術,對相關抗性基因擴增方式方法進行了改進或新建.本研究在設計經過中首先通過Genbank下載相應的抗性基因序列.利用序列分析軟件Vector對下載的基因序列進行比對.通過比對,發(fā)現目的基因片段區(qū)的保守序列,并在該保守序列區(qū)檢索適于作為引物的序列,進行引物設計.引物設計完成后,利用NCBI的BLAST功能在Genbank庫內對相近進行檢索,檢查其特異性.如發(fā)現設計引物與其他基因片段在3段一樣堿基6個,即舍棄重新設計.后經試驗證明,本研究所用引物均具有較好的特異性.本次用于抗性基因監(jiān)測的蚊種群主要來自于主城區(qū).抗性表型測試顯示[9],金華市淡色庫蚊主城區(qū)品系對常見殺蟲劑的抗性水平,除了氯菊酯,基本接近敏感品系.該結果與抗性基因測序結果相一致.本研究中檢測的6個基因片段中,金華市淡色庫蚊現場品系與敏感品系的氨基酸序列完全一樣.金華市淡色庫蚊主城區(qū)品系氯菊酯抗性水平明顯高于敏感品系.在本研究中抗性基因測序結果無法解釋其抗性產生原因,可能已檢測的基因片段未覆蓋突變位點,或存在其他未知抗性機制.金華市淡色庫蚊主城區(qū)品系氯菊酯抗性產生機制,還有待進一步研究.以下為以下為以下為以下為參考文獻[1]丁矛.昆蟲抗藥性相關基因芯片的研制及其應用[D].杭州:浙江大學昆蟲科學研究所,2006.[2]公茂慶,劉波,胡小邦,等.淡色庫蚊Cyp6f1基因的克隆及表示出差異的鑒定[J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械,2008,14(2):100-104.[3]孫靜,錢瑾,孫立新,等.淡色庫蚊抗性相關基因Nyd-Gbe基因的克隆與分析[J].南京醫(yī)科大學學報:自然科學版,2006,26(7):477-480.[4]錢瑾,孫靜,孫立新,等.淡色庫蚊抗藥性相關基因Nyd-Mlc2基因的克隆與分析[J].南京醫(yī)科大學學報:自然科學版,2006,26(7):473-476.[5]TomaL,MenegonM,RomiR,etal.StatusofinsecticideresistanceinCulexpipiensfieldpopulationsfromnorth-easternareasofItalybeforethewithdrawalofOPcompounds[J].PestManagSci,2018,67(1):100-106.[6]ChenL,ZhongD,ZhangD,etal.MolecularecologyofpyrethroidknockdownresistanceinCulexpipienspallensmosquitoes[J].PLoSOne,2018,5(7):11681.[7]TantelyML,TortosaP,AloutH,etal.InsecticideresistanceinCu-lexpipiensquinquefasciatusandAedesalbopictusmosquitoesfromLaReunionIsland[J].InsectBiochemMolBiol,2018,40(4):317-24.[8]MatamboTS,PaineMJ,CoetzeeM,etal.SequencecharacterizationofcytochromeP450CYP6P9inpyrethro