基因治療的一個發(fā)展

基因治療的一個發(fā)展第1頁/共20頁匯報內(nèi)容基因治療的概念基因治療應(yīng)用的途徑常見疾病的基因治療基因治療存在的危險性第2頁/共20頁基因治療基因治療定義1.（從原理）指將正常和野生型的基因插入靶細胞的染色質(zhì)基因組中，以補充缺失基因或置換致病基因，從而產(chǎn)生新的表型的一種治療方法。2.（從應(yīng)用）試圖從基因水平調(diào)控細胞中缺陷基因的表達，或以正?；虺C正、代替缺陷的基因，以此治療基因缺陷所致的遺傳病、免疫缺陷、或治療因癌基因激活/或抑癌基因失活所致的腫瘤。第3頁/共20頁第4頁/共20頁基因治療技術(shù)1）化學(xué)法：將正?；駾NA（及其拷貝）與輔助物混合，形成的物質(zhì)直接傾入培養(yǎng)基中與細胞接觸，將DNA輸入細胞內(nèi)，并整合于受體細胞的基因組中，在適當?shù)臈l件下，整合基因得以表達。這種方法簡單，但效率極低。2）物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。①電穿孔法：通過電擊使細胞細胞膜發(fā)生變化，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進細胞，但有時也會使細胞受到嚴重損傷。②顯微注射法：顯微注射是在顯微鏡直視下，向細胞核內(nèi)直接注射外源基因，但一次只能注射一個細胞，工作耗力費時。3）同源重組法：同源重組法是將外源基因定位導(dǎo)入受體細胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達到修正缺陷基因的目的。但對于體細胞基因治療，體外培養(yǎng)細胞的時間不能過長，篩選量大，故在臨床上應(yīng)用也受限制難以進行。若提高重組率，這種方法則得以發(fā)展。第5頁/共20頁基因治療技術(shù)4）病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：（目前最常用）病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是以病毒為載體，將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓重組病毒去感染受體宿主細胞。目前應(yīng)用的有兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法。①反轉(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，RNA利用反轉(zhuǎn)錄生成為DNA，再整合到宿主細胞基因組。優(yōu)點：轉(zhuǎn)化細胞效率高；感染廣譜動物物種和細胞類型；可長期存留，一般無害于細胞。缺點：只能把其DNA整合到能旺盛分裂細胞的染色體；有使宿主細胞感染病毒和致癌的危險性；由于病毒整合基因組是隨機的，可能激活細胞的原癌基因，以及因隨機插入發(fā)生插入突變。②DNA病毒介導(dǎo)載體：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認為這類病毒難于改造成缺陷型病毒。后來證明，載有外源DNA的復(fù)制缺陷腺病毒呈現(xiàn)與普通DNA相同繁殖的特點。第6頁/共20頁病毒性疾病的基因治療

隨著對乙型肝炎病毒（HBV）基因組的序列、結(jié)構(gòu)蛋白的功能及其生命周期的進一步了解，產(chǎn)生了一系列針對阻斷病毒基因的表達或功能的基因治療方法。

1反義寡核苷酸

反義寡核苷酸指合成的20個堿基左右的一小段核苷酸，按照沃森-克里克堿基配對原則，與特定的靶序列雜交，從而抑制基因的表達。當反義寡核苷酸特異地與HBVmRNA結(jié)合形成RNA-DNA（反義DNA）或RNA-RNA（反義RNA）雜交體，可定向抑制和阻斷其復(fù)制和表達。

2核糖核酸酶

核糖核酸酶是一類具有催化活性的小分子RNA，能特異地結(jié)合于靶RNA上，形成RNA-RNA雜交體，催化特定序列RNA分子的切割。

核糖核酸酶基因能通過多種病毒（載體傳遞系統(tǒng)被傳遞，并在靶細胞中持續(xù)表達。由于其可以不可逆的使靶RNA失活，可在體外循環(huán)利用，催化效率高，能避免重復(fù)給藥，可能產(chǎn)生終生保護。

3顯性失活突變體（DN突變體）

細胞內(nèi)干擾性多肽蛋白的合成能干擾其正常對應(yīng)物的生理功能。顯性失活突變體在體外可特異性抑制HBV復(fù)制，是值得研究的新型抗病毒劑。

顯性失活突變體優(yōu)于核糖核酸酶、反義寡核苷酸,潛在優(yōu)勢在于它與病毒序列變異無相關(guān)性，從而減少了形成或累積成“治療逃逸突變株”的危險；而且產(chǎn)生抗病毒作用所需的細胞內(nèi)濃度相對較低；再者，DN突變體不影響細胞的轉(zhuǎn)錄，所以對轉(zhuǎn)染的細胞沒有直接的毒性作用。

第7頁/共20頁癌癥的基因治療1.基因?qū)蛎附馑幬锴绑w治療（GDEPT）

GDEPT是通過利用腫瘤細胞和正常細胞之間基因表達的差異，使某一酶基因僅在腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄表達，以增加腫瘤基因治療，破壞細胞的特異性。2.插入自殺基因?qū)⒕幋a某一敏感性因子的基因轉(zhuǎn)入靶腫瘤細胞，使該細胞對換某種原本無毒或低毒的藥物產(chǎn)生特異的敏感性而死亡。這一表達敏感性因子的基因稱為藥物敏感基因或自殺基因。

多數(shù)自殺基因療法研究是通過編碼病毒或細菌的酶來介導(dǎo)藥物敏感性，即腫瘤細胞產(chǎn)生的酶把藥物的無活性形式轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物，從而抑制核酸合成。自殺基因治療的缺點是僅殺傷S期細胞，即僅能誘導(dǎo)一小部分分裂細胞發(fā)生死亡。3.腫瘤細胞藥物增敏基因治療

該療法是指將外源基因插入腫瘤細胞后，改變腫瘤細胞對藥物的敏感性。如將鈣調(diào)素基因轉(zhuǎn)入癌細胞，利用其對癌細胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用，使癌細胞對化療藥物的敏感性明顯提高。4.腫瘤耐藥基因治療

通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)移耐藥基因到正常器官組織，以保護其免受化療藥物的毒性作用。該療法可以提高化療效果。第8頁/共20頁基因治療成功案例重癥聯(lián)合免疫缺陷（scid）是由于腺苷脫氨酶ADA缺陷所致。ADA活性缺陷性疾病為常染色體隱性遺傳病?；颊弑憩F(xiàn)為，易感染。檢查可發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細胞數(shù)減少（嚴重的淋巴細胞減少癥）和低免疫球蛋白血癥。

法國巴黎某醫(yī)院的一位博士及其同事已成功治療了4例(4/5)scid患兒。他們?nèi)コ純汗撬瑁迯?fù)未成熟免疫細胞的遺傳缺陷，然后將修正的細胞再輸入患兒體內(nèi)。不足4個月，4名患兒體內(nèi)即出現(xiàn)了成熟t細胞和自然殺傷細胞，治療2年多后其t細胞反應(yīng)仍接近正常。第9頁/共20頁第10頁/共20頁干細胞治療干細胞是具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細胞，是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的原始細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞或組織器官，醫(yī)學(xué)界稱其為“萬用細胞”。干細胞治療是把健康的干細胞移植到病人或自己體內(nèi)，以達到修復(fù)病變細胞或重建功能正常的細胞和組織的目的。干細胞療法就像給機體注入新的活力，是從根本上治療許多疾病的有效方法。1、干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病如：腦癱、脊髓損傷、運動神經(jīng)元病、帕金森病、腦出血、腦梗塞后遺癥、腦外傷后遺癥等；2、干細胞治療免疫系統(tǒng)疾病如：糖尿病、皮肌炎、肌無力、血管病變、硬化病、白血病等；3、干細胞治療其他疾?。喝绺尾　⒏斡不?、股骨頭壞死等；4、干細胞治療腎病。第11頁/共20頁基因治療的危險性1.病毒載體的安全性將外源基因?qū)爰毎姆椒ê芏啵畛Ｓ玫姆椒ㄊ且圆《咀饔幂d體進行的基因轉(zhuǎn)移，如腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等載體等介導(dǎo)的、基因轉(zhuǎn)移這些關(guān)于基因治療的載體系統(tǒng)都是經(jīng)過人工改造的一些缺陷性病毒。可是是否存在著在人體組織細胞內(nèi)通過重組或突變兒“復(fù)活”的可能。雖然在人體內(nèi)通過回復(fù)突變兒“復(fù)活”的可能性極小，而且隨著技術(shù)的改進，這種回復(fù)突變的可能性又有所下降，但是我們也不能因此而放松警惕。2.癌基因的活化問題當病毒載體攜帶基因進入人體后，它本身是無法定位的，這種不確定性表現(xiàn)在兩個方面：一是靶細胞的轉(zhuǎn)移是非特異性感染；二是基因組的整合為非定點整合。經(jīng)基因治療的療效發(fā)揮以及副作用的產(chǎn)生帶來了很大的不確定性，插入突變可能使一個重要基因失活或者更嚴重的是激活一個愿癌基因。這個問題的危險程度到底多大現(xiàn)在未知。3.免疫反應(yīng)病毒載體可能引起免疫反應(yīng)而使受治療者死亡，且這一方面很難克服。相關(guān)案例相關(guān)案例第12頁/共20頁基因治療存在的不良反應(yīng)1、病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)病毒載體能夠?qū)е履X和脊髓的炎癥。雖然用于轉(zhuǎn)染的腺病毒不能在細胞內(nèi)自我復(fù)制，但這種復(fù)制缺陷重組腺病毒在體內(nèi)不僅能引起中樞的局部炎癥還能引起外周的免疫反應(yīng)。復(fù)制缺陷重組腺病毒能直接損傷細胞但卻不引起明顯的全身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，提示病毒介導(dǎo)的細胞損傷可能不全依靠細胞免疫和體液免疫。另一方面，有些病毒蛋白能防止神經(jīng)元的凋亡，而另一些卻加強了對TNF介導(dǎo)的凋亡的敏感性。2、外周免疫反應(yīng)將病毒導(dǎo)入腦和脊髓能誘發(fā)外周的免疫反應(yīng)。免疫抑制能降低腺病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并增強轉(zhuǎn)染基因的穩(wěn)定性。第13頁/共20頁基因治療的某些觀點

基因治療存在技術(shù)上的缺陷和不安全因素，病人不但可能得不到有效合理的治療，而且容易成為新生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的試驗品?；蛑委熤凶畲蟮膯栴}就是外源基因不能穩(wěn)定地、持續(xù)地、高效地表達，在動物實驗中最長的報道也僅二年，大多在3—6個月之間，醫(yī)學(xué)臨床上的療效也多為暫時性的。由于缺少基礎(chǔ)研究，縱使哪些人們認為已經(jīng)比較清楚的疾病，也并非沒有問題。而遺傳病、癌癥等病因異常復(fù)雜的疾病，存在的問題就更多，更不能盲目的應(yīng)用于臨床。

對人類的基因干預(yù)有可能引發(fā)現(xiàn)存人類道德不能包容的倫理難題，也是引致廣泛爭論的話題。

基因治療在美國實行之初，曾經(jīng)遭到社會的強烈反對，反對意見中呼聲最高的是「人類不該取代上帝」。這些意見背后包含大眾對操作基因感到的恐懼與威脅；更多人擔心，如果允許進行基因治療，今后人類對于基因操縱的層面就會不斷擴大，將來甚至可能發(fā)展成操縱生殖細胞，而這種危險終將給人類后代帶來深遠影響?；蛑委煹膫惱韱栴}第14頁/共20頁懇請各位老師同學(xué)批評指正?。?！第15頁/共20頁基因治療的倫理問題關(guān)于基因治療途徑的問題

體細胞途徑的基因治療:只涉及受治者本身，基因治療中轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)，僅在被傳導(dǎo)的部分的靶細胞中具有活性，不會傳到相鄰的其他類型的體細胞中，更不會通過其生殖細胞傳給后代。對別人或其后代無影響，從社會倫理道德這一角度上來講，醫(yī)生根據(jù)目前科學(xué)和技術(shù)的進展和條件，最大限度的發(fā)揮其治療對病人帶來的好處，最大限度的降低基因治療可能給病人造成的傷害，將整個基因治療的程序和可能的后果詳細介紹給病人，并征得病人的同意方可進行。生殖細胞的基因治療:是目前國際上嚴格禁止的。因為生殖細胞的基因治療不僅影響到接受基因治療者本身，而且轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)可隨生殖細胞一代一代傳下去，這樣生殖細胞就有可能打亂整個人類的遺傳信息系統(tǒng)，將給整個人類帶來極為嚴重的后果，應(yīng)當嚴格禁止。關(guān)于基因表達的水平問題將一些基因?qū)氲饺梭w提高機體某一方面功能，改進機體的某些特點，但什么樣的基因表達水平是病人最理想的，這仍然是一個無法解決的問題。那么什么樣的基因表達水平才能使病人達到正常，如將生長激素基因?qū)胝和w內(nèi)使其長的更高，就不符合人類基因治療的社會倫理道德標準?；蛑委熍c治療者（病人）第16頁/共20頁基因治療史上關(guān)于治療者的問題知情選擇時的“治療性誤解”“研究”是要獲得新知識（如有價值的數(shù)據(jù)和資料），“治療”是要借助有明確療效的方法來治病救人。顯然，基因治療僅僅是一種臨床研究，并非成熟的治療方案。不少研究者在實踐中存在用“臨床治療”代替“臨床試驗”的問題。由于廣大患者對不同臨床階段基因治療的目的、安全有效性不一定很熟悉，受試者難免會認為將從中獲得直接的治療利益。當混淆了“治療”和“研究”時，在知情同意過程中的“治療性誤解”就難以幸免。

研究者盡可能以受試者可接受的方式告知各種潛在的風(fēng)險和受益，并提供估計“風(fēng)險/受益”比的方法。既要慎重對待各種潛在的風(fēng)險，但又不可因噎廢食，要在“不傷害”和“有利”之間找到平衡點。試驗者考慮導(dǎo)入的基因是否穩(wěn)定高效表達、載體的毒性等。但僅僅做到“不傷害”并非基因治療的本意，它須對病人有預(yù)防、治愈、緩解、減輕疾病的功效，對整個人類的健康有利。返回第17頁/共20頁基因治療失敗實例18歲的格爾辛基因臨床試驗的某些失誤而于1999年9月17日死亡。格爾辛基是世界上首位由基因治療導(dǎo)致喪生的患者。他患先天性鳥氨酸甲酰氨基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥病癥，在男性身上較嚴重，往往引起新生男嬰患者的死亡。

此次事件發(fā)生與賓夕法尼亞大學(xué)在基因治療中急于上臨床、忽視試驗規(guī)則有很大