第八章酶的定向進化

利用酶作為催化劑進行生物催化與生物轉(zhuǎn)化，已廣泛應用于各個領域：醫(yī)藥方面、食品工業(yè)方面、輕工、化工方面、能源開發(fā)方面、環(huán)境保護方面等等當前1頁，總共73頁。天然酶的局限：酶催化的精確性和有效性常常不能很好地滿足酶學研究和工業(yè)化應用的要求而且天然酶的穩(wěn)定性差、活性低使催化效率很低還缺乏有商業(yè)價值的催化功能，尤其是對一些非天然底物具有惰性在非水環(huán)境下的低活力對輔酶的依賴等當前2頁，總共73頁。能具備長期穩(wěn)定性和活性能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料現(xiàn)代生物工程的要求當前3頁，總共73頁。如何利用相對簡單的方法以達到對天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應用前景當前4頁，總共73頁。試管中的進化是生物工程的未來——諾貝爾獎獲得者

M.Eigen當前5頁，總共73頁。內(nèi)容簡介酶定向進化簡介：基本原理、研究歷史定向進化的策略：無性進化、有性進化、同源重組基因文庫的構(gòu)建與篩選：考慮要素、構(gòu)建策略、構(gòu)建載體系統(tǒng)、文庫篩選定向進化應用定向進化優(yōu)勢、現(xiàn)狀和未來當前6頁，總共73頁。1.研究歷史第一次在分子水平上定向改造單一分子的是SolSpiegelman在20世紀60年代利用RNA噬菌體Q進行的一個實驗，當時他的目的是為了證明達爾文的自然選擇也可以發(fā)生在非細胞體。此實驗并沒有實際的應用價值1981年，B.G.Hall等報道了他們定向改變大腸桿菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物專一性，開發(fā)出對幾種糖苷鍵有水解能力的酶。1986年R。Hageman等進行了開發(fā)有效提高常溫生物中酶分子熱穩(wěn)定性的實驗。當前7頁，總共73頁。將對卡那霉素有抗性的卡那霉素核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化進大腸桿菌，獲得基因的突變庫將突變庫轉(zhuǎn)入可以在高溫下生長的耐熱菌，即嗜熱脂肪芽孢桿菌中通過在高溫下進行篩選獲得了一個在63℃下穩(wěn)定的突變酶(Asp80Try)和一個在70℃穩(wěn)定的突變酶(Asp80Try，Thr130Lys)當前8頁，總共73頁。2.基本原理利用基因工程原理在實驗室中模擬生物進化過程化學進化生物進化當前9頁，總共73頁。當前10頁，總共73頁。生物的自然進化進化過程：突變→自然選擇→遺傳后代進化結(jié)果：

基因多樣性：為完成同一功能所表現(xiàn)出的多個基因或同一個基因(同源基因，或同工酶)

代謝途徑的多樣性：同樣產(chǎn)物，多條途徑（木糖——木酮糖）

代謝產(chǎn)物的多樣性：同一底物，不同產(chǎn)物

生物多樣性：整個生態(tài)系統(tǒng)中的生物當前11頁，總共73頁。什么是定向進化技術(shù)概念提出：1993年，美國科學家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進化的概念，并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶。酶分子改造：化學修飾，定點突變定向進化當前12頁，總共73頁。模擬自然進化的過程，進行人工隨機突變，并在特定的環(huán)境條件下進行選擇，使進化朝著人們所需方向發(fā)展的技術(shù)過程。當前13頁，總共73頁。定向進化與自然進化的異同點定向進化的實質(zhì)是達爾文進化論在分子水平上的延伸和應用。定向進化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進化，使進化朝著人們需要的方向發(fā)展。兩者的不同：進化動力不同：保守突變非保守取代；進化方向不同：適應突變的積累；進化速度不同：非常漫長只需幾年、甚至幾天；

進化目標不同：適應環(huán)境超越生物學意義的要求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。當前14頁，總共73頁。酶分子定向進化模擬自然進化過程(隨機突變+自然選擇)，在體外對酶基因進行人工隨機突變，建立突變基因庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有預先期望的具有某些特性的酶的突變體的技術(shù)過程。當前15頁，總共73頁。隨機突變+定向選擇＝目標突變體細菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！當前16頁，總共73頁。屬于蛋白質(zhì)的非合理設計，它不需要事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制，人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)的突變酶。當前17頁，總共73頁。對酶分子的研究可以分為認識和改造兩個方面，前者是利用各種生物化學，晶體學光譜學等方法對天然酶或其突變進行研究，獲得酶分子特征，空間結(jié)構(gòu)和功能之間的關系以及氨基酸殘基功能等方面的信息，以此為依據(jù)對酶分子進行改造，成為酶分子的合理設計。如化學修飾，定點突變等。當前18頁，總共73頁。澄清一個事實：定向進化不是定點突變定向進化：突變篩選

突變位點是隨機的，不確定的；突變位點的數(shù)目也是不確定的；突變的效應更是不可預知的；理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學的，生物的）都可以應用于定向進化中突變體的產(chǎn)生。定點突變：

突變位點是確定的，突變的個數(shù)也是預知的；突變的效應可能是已知的，也可能是未知的；定點突變的方法一般是以PCR技術(shù)為基礎的。當前19頁，總共73頁。3.定向進化的基本過程隨機突變構(gòu)建突變基因文庫定向篩選當前20頁，總共73頁。3.1隨機突變易錯PCR技術(shù)DNA重排技術(shù)(DNAShuffling)基因家族重排技術(shù)當前21頁，總共73頁。易錯PCR技術(shù)當前22頁，總共73頁。降低一種dNTP的量（降至5％-10％）加入dITP來代替被減少的dNTP緩沖液中另加0.5mmol/LMn2+提高Mg2+濃度當前23頁，總共73頁。優(yōu)點：簡便，隨機突變豐富缺點：正突變率低，突變基因文庫大，篩選工作量大。適用于較小基因的定向進化當前24頁，總共73頁。DNA重組技術(shù)(DNAShuffling)1.DNaseI產(chǎn)生隨機片段；2.隨機片段變性；3.隨機片段復性；4.延伸反復重復2-4步后，可獲得全長DNA片段當前25頁，總共73頁。DNA改組具有以下有用的特征：①它可以利用現(xiàn)存的有力突變，快速積累不同的有利突變；②重組可伴隨點突變同時發(fā)生；③可以刪除個體中的有害突變和中性突變。缺點：DNA改組過程中伴隨的較高待點突變頻率會嚴重阻礙正突變組合的發(fā)現(xiàn)。由于絕大多數(shù)突變是有害的，有利突變的重組和稀少有利點突變會被有害突變的負背景所掩蓋。當前26頁，總共73頁。DNAshuffling技術(shù)的改進交錯延伸技術(shù)隨機引物體外重組技術(shù)當前27頁，總共73頁。交錯延伸技術(shù)在PCR反應中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,縮短其反應時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復進行，直到產(chǎn)生完整的基因長度。當前28頁，總共73頁。當前29頁，總共73頁。隨機引物體外重組技術(shù)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的短DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應中，它們互為引物進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。當前30頁，總共73頁。當前31頁，總共73頁?；蚣易逯嘏偶夹g(shù)酶切無引物PCR當前32頁，總共73頁。Crameri等人在實驗中選用了4個1.6kb來自不同菌屬但同樣編碼頭孢菌素C酶的基因，它們之間具有58％～82％的同源性。用這4個基因分別或共同作為出發(fā)序列進行DNA改組，把同樣的轉(zhuǎn)化子涂在含有16～32ug/ml的拉氧頭孢的平板上，經(jīng)過多輪改組進化，分別得到對拉氧頭孢由最高抗性的菌株。當前33頁，總共73頁。3.突變體文庫的構(gòu)建突變基因突變體基因文庫表達載體當前34頁，總共73頁。3.1文庫質(zhì)量要求包容性：盡可能包含基因的任何一種可能的突變信息完整性：盡可能完整反映基因的結(jié)構(gòu)和功能信息，以便篩選得到具完整功能的進化酶當前35頁，總共73頁。表達載體：λ噬菌體載體系統(tǒng)：最早使用。適合大片段的克??；轉(zhuǎn)染率高，可達106以上；質(zhì)量控制較好；適合長期保存。質(zhì)粒載體系統(tǒng)：體外操作簡便，設計上具有很大的可塑性；能夠?qū)崿F(xiàn)對基因文庫的功能型篩選。但：插入片段容量小，長片段再群體擴增時易丟失；轉(zhuǎn)化效率較低；不能長期保存。組裝當前36頁，總共73頁。3.2突變庫的篩選1.定向選擇環(huán)境條件的設定逐步改變調(diào)整所設定的環(huán)境條件當前37頁，總共73頁。2.高通量篩選平板篩選熒光篩選噬菌體表面展示酵母表面展示核糖體展示當前38頁，總共73頁。平板篩選依據(jù)重組細胞的表型，包括細胞生長狀態(tài)、顏色變化情況、透明圈情況等進行篩選。使抗生素失效的酶類(如頭孢菌素酶，b

-乳糖酶）提高耐熱性易于觀察的菌落表型（如菌落顏色等）營養(yǎng)缺陷型的輔助篩選當前39頁，總共73頁。噬菌體展示根據(jù)所需要的特性，對經(jīng)Shuffling后的DNA文庫在噬菌體或細菌細胞表面（細菌、纖毛蟲細胞表面）的表現(xiàn)特征進行篩選，獲得提高目的底物親和力的突變子。當前40頁，總共73頁。M13phage絲狀噬菌體M13基因組是單鏈環(huán)狀DNA主要外殼蛋白是基因VIII編碼的蛋白質(zhì)少量外殼蛋白是基因III、VI、VII和IX編碼的蛋白當前41頁，總共73頁。絲狀噬菌體的生活周期當前42頁，總共73頁。噬菌體顯示篩選模式當前43頁，總共73頁。噬菌體顯示的幾種類型當前44頁，總共73頁。M13噬菌體pIII和pVIII的顯示當前45頁，總共73頁。酵母雙雜交展示典型的真核生物轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）含有兩個不同結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當部位打開，仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體;b含DNA-activatingdomain的載體。當前46頁，總共73頁。當前47頁，總共73頁。4.酶定向進化的應用提高酶催化效率改變底物特異性改善酶的穩(wěn)定性獲取具有新功能的酶提高藥用蛋白和疫苗的活性當前48頁，總共73頁。提高酶活力L—天冬氨酸酶定向進化研究進行4輪易錯PCR，篩選了3000個菌落。得到酶活力提高28倍的突變體，該酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于天然酶當前49頁，總共73頁。提高穩(wěn)定性T4溶菌酶11個不同的單點突變株將Tm提高0.8-1.4℃.8株大腸桿菌核酸酶HI單點突變中，7株Tm提高了0.7-4.2℃當前50頁，總共73頁。提高底物的專一性Gulick分離到了一株谷胱苷肽轉(zhuǎn)硫酶，對于癌癥治療中烷化劑的耐受力提高了9倍Widersten利用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)來增加谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶與親電底物結(jié)合力，沒有成功當前51頁，總共73頁。對映體選擇性的定向進化S型選擇性的轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化?-丁酮，僅有65%的手性專一性。通過10000個隨機突變的菌株的篩選，獲得10個手性專一性在80%-94%之間的酶當前52頁，總共73頁。交換催化反應的專一性來源于銅綠假單胞菌的脂肪酶對于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸鹽的S構(gòu)型的選擇性2%。經(jīng)過4輪易錯PCR突變和篩選后，它對底物的S型的選擇性達到81%當前53頁，總共73頁。Fig.1.Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004.TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase.Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles.當前54頁，總共73頁。目標酶所需功能方法結(jié)果實施菌種卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性定位誘變+選擇在60-50℃酶半衰期增加200倍耐熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶作用于有機溶劑易錯PCR+選擇在60％二甲基亞砜主仆女冠活力增強170倍枯草桿菌β-內(nèi)酰胺酶作用于新底物DNA改組+選擇對cefotaxime的抗性增加32000倍大腸桿菌對硝基苯酯酶有機溶劑中的底物特異性和活性易錯PCR+重組活力增加60-150倍大腸桿菌胸苷激酶第五特異性基因理療交錯延伸+選擇活力增加43倍大腸桿菌β-半乳糖苷酶底物特異性DNA改組+選擇活力增加66倍底物特異性增加1000倍大腸桿菌砷酸脫毒途徑砷酸抗性DNA改組+選擇抗性增加12倍大腸桿菌定向進化的應用當前55頁，總共73頁。展望總之，具有新功能和特性的酶可以通過從大量未知的自然種系中尋找以及對現(xiàn)有的天然酶進行改造，對現(xiàn)有的天然酶進行改造可能更加合適。我們相信，隨著基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)以及高通量篩選技術(shù)的迅速發(fā)展，定向進化技術(shù)將成為獲得新酶的一個有效快捷的手段，這將為工業(yè)生產(chǎn)提供更多性能優(yōu)良的酶制劑。當前56頁，總共73頁。參考文獻NikolaosE.Labrou.Directedenzymeevolution:Bridgingthegapbetweennaturalenzymesandcommercialapplications.BiomolecularEngineering2005,22:vii–ix.HaiyanTao.Milestonesindirectedenzymeevolution.CurrentOpinioninChemicalBiology2002,6:858–864.LindaG.Otten.Directedevolution:selectingtoday’sbiocatalysts.BiomolecularEngineering2005,22:1–9EdgardoTFarinas.Directedenzymeevolution.CurrentOpinioninBiotechnology2001,12:545–551ValeryA.Detectionofbiologicalthreats.Achallengefordirectedmolecularevolution.JournalofMicrobiologicalMethods2004,58:147–168NicholasJ.Turner.Directedevolutionofenzymesforappliedbiocatalysis.TRENDSinBiotechnology2003,11(21):474-478JoelRCherry.Directedevolutionofindustrialenzymes:anupdate.CurrentOpinioninBiotechnology2003,14:438–443PaulADalby.Optimisingenzymefunctionbydirectedevolution.CurrentOpinioninStructuralBiology2003,13:500–505VincentG.H.Directedevolutionofenzymestability.BiomolecularEngineering2005,22:21–30當前57頁，總共73頁。張今.進化生物技術(shù)—酶定向進化.北京:科學出版社,2004李紅梅,李樂和.蛋白質(zhì)模擬技術(shù)在細胞色素P450BM3的定向進化中的應用.蛋白質(zhì)多肽藥物學術(shù)會議論文集：41-44催化吲哚生成靛藍的細胞色素P450BM3定向進化研究.蛋白質(zhì)多肽藥物學術(shù)會議論文集：36-40張紅纓.蛋白質(zhì)工程的新策略—酶的體外定向進化.科學通報.1999,44(11):1121-1125徐威.酶定向進化的研究策略.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志.2004,35:436-441張今.進化生物技術(shù)—酶定向進化.醫(yī)學分子生物學雜志.2004,1(6):327-333胡軍.酶技術(shù)發(fā)展與酶定向進化.工業(yè)微生物.1999,29(4):37-42雷啟義.酶定向進化的研究進展.黔東南民族師范高等?？茖W校學報2005,23(3):25-27吳梧桐.蛋白質(zhì)工程技術(shù)與新型生物催化劑設計.藥物生物技術(shù).2004,11(1):1-6當前58頁，總共73頁。幾種定向進化技術(shù)的比較及文庫構(gòu)建策略.中國生物工程雜志.2003,23(12):68-73生物技術(shù)新熱點.國外科技動態(tài)肖志壯.蛋白質(zhì)定向進化的研究進展.生物工程進展.2001,21(6):31-34潘力.酶立體選擇性的定向進化及其高通量篩選方法.化學通報.2004,8:582-587徐卉芳.體外分子定向進化研究進展.生物化學與生物物理進展.2002,29(4):518-521許欽坤.蛋白質(zhì)定向進化的研究進展及其應用前景.生物技術(shù)通訊.2005,16(2):191-193方柏山.酶體外定向進化(Ⅱ)文庫篩選的方法及其應用.華僑大學學報.2005,26(2):113-116方柏山.酶體外定向進化(Ⅰ)突變基因文庫構(gòu)建技術(shù)及其新近展.華僑大學學報.200425(4):337-342當前59頁，總共73頁。當前60頁，總共73頁。當前61頁，總共73頁。成功實例Lipasegenes(lipB52,lipB68)isolatedfromPseudomonasfluorescensB52、B68

GenbankAccssionnumberAY623009、AY694785當前62頁，總共73頁。成功實例

Lipasegene(lipB52）expressedinPichiapastorisKM71

ZhengbingJiang,Yitaozheng,YuLuo,GangWang,HongpingWang,YushuMaandDongzhiWei*.CloningandExpressionofaNovelLipaseGeneFromPseudomonasfluorescensB52.MolecularBiotechnology.2005(31),095-102.SDSanalysisoflipaseonexpressionandpurificationfunctionallipasesecretedbyRecombinantsscreenedwithBMMYplates當前63頁，總共73頁。EnantioselectiveesterificationofR-phenylethanol,S-phenylethnolremainedatitsoriginalformeep＞98.7%andconversion＞48.1%at40oCfor48hours.ModelChiralReactionCatalyzedbyLipaseB52當前64頁，總共73頁。Transesterificationbetweensoybeanoilandmethanol.Conversion＞90%at40oCfor35hoursProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB52當前65頁，總共73頁。CharacterizationofapsychrophiliclipasefromPseudomonasfluorescensstrainB68p-nitrophenylcaprateassubstrate.Optimaltemperatureas20C，50%activityat0C。HydrolyzationactivityoflipaselipB68

當前66頁，總共73頁。ChiralselectivityoflipB68ModelReaction：Chiralresolutionof-phenylethanoland-phenylpropanolviaesterification.

Reactionsystemcontained:0.5mmolofracemic-phenylethanolor-phenylpropanoldissolvedin10mltoluenecontaining1mmolofvinylacetate,with0.5gimmobilizedenzymeadded.Samplestakenat120hourandsubjectedtoGCanalysis.當前67頁，總共73頁。ProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB68Yieldto92%at20Cand24hourswithimmobilizedlipB68.Thelowesttemperaturereportedpreviously.ProductionofbiodieselfromsoybeanoilbyimmobilizedlipB68當前68頁，總共73頁。LipaseR&Dfromunculturedmicroorganism

——Lipasegenes(lip