dnmt1,dnmt3a dnmt3b和hmt在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)及意義

世界消 ;16(4):426- ISSN1009-3079CN14-研究快報(bào)RAPID Dnmt3b和HMT在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系的,,王國斌,許飛,田元,表遺傳學(xué)研究是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一回顧性的研究資料表明腫瘤細(xì)胞中存在異常的DNA甲基化模式甲基化等表遺傳學(xué)修飾與的發(fā)生密,醫(yī)師,廣州市第一人民

,,王國斌,,, ,華技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外科省市430022國家自然科學(xué)基金資助課題,作者貢獻(xiàn)分布:此課題由 ,王國斌設(shè)計(jì);研究過程 ,,及 工具由, 提供;數(shù)據(jù)分析由 完成;本論 ,王國斌完成. ,430022,省市,華技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外科.c :收稿日期:2007-09-18修回日期:2008-01-ExpressionofDnmt1,Dnmt3a,Dnmt3bandHMTindifferentcoloniccancercelllinesanditssignificanceRong-LinZhai,Kai-LinCai,Guo-BinWang,FeiXu,YuanTian,Jing-HuiZhangRong-LinZhai,Kai-LinCai,Guo-BinWang,FeiXu,YuanTian,Jing-HuiZhang,DepartmentofGeneralSur-gery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,Hu-beiProvince,Supportedby:NationalNaturalScienceFoundationof,No.Correspondenceto:Kai-LinCai,DepartmentofGen-eralSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,HubeiProvince,.c Received:2007-09-18Revised:2008-01-08AIM:TodeterminetheexpressionofDNAmethyltransferaseandhistonemethyltransferase(HMT)mRNAindifferentcoloniccancercellMETHODS:ExpressionofDnmt1,Dnmt3a,Dn-mt3bandHMTmRNAwasdetectedinHT-29,LovoandCaco-2cellsbyRT-PCR.

Dnmt3ainHT-29,LovoandCaco-2cells.CONCLUSION:Differentiatedcoloncancercelllinesmayhaveadifferentepigeneticmecha-nism.Dnmt3bmayyavitalroleinthepro-cessofestablishingandmaintainingtheDNAmethylationpattern.:DNAmethyltransferases;Histonemethyltransferase;Methylation;Epigenetics;Coloncancer;Reversetranscription-polymerasechainre-ZhaiRL,CaiKL,WangGB,XuF,TianY,ZhangJH.ExpressionofDnmt1,Dnmt3a,Dnmt3bandHMTindifferentcoloniccancercelllinesanditssignificance.ShijieHuarenXiaohuaZazhi2008;16(4):426-方法:RT-PCR分別檢測結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、Lovo和Caco-2中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和HMTmRNA表達(dá)水平.Dnmt3bmRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、Lovo中高度表達(dá),Dnmt1與HMT次之,Dnmt3a表達(dá)水平最低;Dnmt3b、Dnmt3a在不同結(jié)腸不同的表觀遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制;Dnmt3b在建立:DNA甲基化酶;組蛋白甲基化酶;甲基化;表觀遺傳學(xué);結(jié)腸癌;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),,王國斌,,,.Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b和HMT在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)及意義.世界消化2008;16(4):426-430 /1009-,等.Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b和HMT在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)及意 0變的可逆的表達(dá)調(diào)控過程.主要包括DNA和組蛋白甲基化去甲基化等改變這些可逆的表因,有選擇性表達(dá)組的信息,在維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、組的完整、組織特異性的表達(dá)調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、組印記、女性X失活、細(xì)胞分化和成長等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-3].回顧性的研究資料

Dnmt1Dnmt3b 18S20001000750500250100HLCHLCHLCHLCHL圖1RT-PCR檢測不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中Dnmts與HMTorRNA內(nèi)參;Marker:DNA分子質(zhì)量H:H:HT-L:Lovo相對相對表達(dá)

分析不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中表觀遺傳學(xué)酶譜的表達(dá)水平對研究結(jié)腸癌表觀遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制有較好的指導(dǎo)作用,國內(nèi)目前尚未見相關(guān)報(bào)也表明,腫瘤細(xì)胞中存在異常的DNA甲基化模式:組整體甲基化水平降低,導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性增加;組織特異性的啟動子區(qū)域出現(xiàn)從頭甲基化;原癌多為低甲基化或不充

內(nèi)參甲基化,低甲基化使原癌活化,導(dǎo)致重新開放或異常表達(dá),形成突變熱點(diǎn),增加的不穩(wěn)定性;某些調(diào)控細(xì)胞生長分化的和抑癌基因啟動子因異常甲基化而失活關(guān)閉[4-6].這些都提示我們,甲基化等表遺傳學(xué)修飾與的發(fā)生密切相關(guān)[7].甲基化必然離不開甲基化酶的催化作用[8],Dnmt1,Dnmt3a和Dnmt3b的過度表達(dá)在很多中都有報(bào)道[9-10本文分析比較了不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中表遺傳學(xué)酶譜的表達(dá)水平,為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌表觀遺材料DMEM(Hyclone),胎牛(Gibco),TRIzol(晶美),逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptⅡ(Invitrogen),RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(MBIFermentas),PCR儀(RotorGene3000),PCR引物由生工合成.12.1結(jié)腸癌細(xì)胞株體外培養(yǎng):結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29、Lovo、Caco2培養(yǎng)于高糖型DMEM+100mL/L胎牛.在pH7.4、37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱中孵育.每天觀察細(xì)胞生長狀況,每2d換液,每3-4d傳代.1.2.2RT-PCR檢測Dnmts、HMTmRNA表達(dá)情況:收集HT-29、Lovo、Caco-2細(xì)胞,采用TRIzol分別抽提各種細(xì)胞的總RNA,以人18SrRNA為內(nèi)參照,行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增.15g/L瓊脂糖凝膠電泳分別檢測各自擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠成像分

度比代表mRNA表達(dá)豐度.反應(yīng)條件:圖2Dnmts與HMTmRNA在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中的相對表預(yù)變性5min,94℃變性30s,Tm退火45s72℃延伸30s72℃終末延伸7min,共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)引物序列及Tm值見表1.檢驗(yàn)P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.不同酶在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況不同酶之間,從頭甲基化酶Dnmt3bmRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29中呈現(xiàn)高度表達(dá),維持甲基化酶Dnmt1與組蛋白甲基化酶HMT次之,從頭甲基化酶Dnmt3amRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平最低(P<0.05,圖1,圖2).這表明不同的DNA甲基化酶在建立和維持DNA不同,Dnmt3b在結(jié)腸癌形成不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中酶的表達(dá)情況不同細(xì)胞之間,維持甲基化酶Dnmt1與組蛋白甲基化酶HMT的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異從頭甲基化酶Dnmt3bDnmt3amRNA表達(dá)水平存在明顯的差異(P<0.05).HT-29Dnmt3b呈現(xiàn)為高度表達(dá),則為中低度表達(dá);Dnmt3a也是如此,在HT-29中表現(xiàn)為中度表達(dá)水平,在Lovo和Caco-2中則幾乎不表達(dá)(P<0.05,1,圖2).HT-29為高分化的結(jié)腸癌細(xì)胞株,呈上皮細(xì)胞樣,Caco-2為中分化結(jié)腸癌細(xì)胞,Lovo則為未分化,Dnmt3b和Dnmt3aHT-29Lovo和提示,不同類型與分化程度ISSN1009- CN14-世 消 第4表1RT-PCR檢測引表1RT-PCR檢測引物表遺傳學(xué)酶譜作accessionPrimer5'-TCCACAGTGTTCACAGAGG-3787-2275'-CGGTAGTAGTCGCAGTAGC-5'-GAAGCGGGCAAAGAACAG-780-2455'-TCTTCCACAGCATTCAATTCC-5'-GCTCTTACCTTACCATCG-809-1655'-accessionPrimer5'-TCCACAGTGTTCACAGAGG-3787-2275'-CGGTAGTAGTCGCAGTAGC-5'-GAAGCGGGCAAAGAACAG-780-2455'-TCTTCCACAGCATTCAATTCC-5'-GCTCTTACCTTACCATCG-809-1655'- TCTGAACTGTCTCC-5'-TCATCAGTCGCTACCTCAGAAC-749-2755'-AGTCCATCTCCAGGCTCTCC-5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-551-2005'-GCTGGAATTACCGCGGCT-能存在著迥然不同的表觀遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制,Dn-的表達(dá)水平類似),而在分化不良或未分化的癌是維持胚胎正常DNA甲基化模式和順利發(fā)育所不可或缺的[1].Dnmt1、Dnmt3a、3b這三個(gè)在幾乎所有的正常組織中均呈現(xiàn)廣泛的共同表達(dá),在腫瘤組織中則為過度表達(dá)9.Dnmt1達(dá)是甲化的要因,與紊亂有關(guān),Dnmt1高表達(dá)總是伴有總組DNA低甲基化和癌低甲基化或抑癌高甲基化112;Rm1R1和p16等腫瘤相關(guān)啟動子發(fā)生去甲基化而重新表達(dá)[13],Dnm1敲除則與染色質(zhì)不穩(wěn)定密切相關(guān)14.與結(jié)腸黏膜和良變相比,結(jié)Dnmt1和Dnmt3a表達(dá)顯著增高,結(jié)直腸癌的表遺傳學(xué)調(diào)節(jié)是通過甲基化活性增強(qiáng)而不是去甲基化活性減弱來實(shí)現(xiàn)的[9].有研究表明,Dnmt1蛋白在胃癌和結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)與、不相關(guān),與腫瘤分化程度顯著相關(guān).rutetal[17]檢測130例中,Dnmt3a,Dnmt3b的mRN表達(dá)情況,結(jié)果顯示Dnmt3b的表達(dá)量最高,而Dnmt1、Dnmt3表達(dá)豐度較低.我們的研究也發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌細(xì)胞株-9中m3bRA表現(xiàn)為高表達(dá),t1和Dnmt3a則分別為中低度表達(dá).不過也有認(rèn)為,結(jié)腸癌組織中DN甲基化酶與CpG島的甲基化并不相關(guān)[1819,說明

盡管在哺乳動物中,Dnmt1的主要功能被認(rèn)為是維持甲基化,而Dnmt3a和Dnmt3b的功能主要是從頭甲基化,有研究卻表明這三個(gè)酶很可化模式的過程[20-22Dnmt1和Dnmt3a同時(shí)起作用時(shí),表現(xiàn)出近5倍的相比于各自單獨(dú)作用的甲基化酶活性,Dnmt3a始發(fā)啟動從頭甲基化后,半甲化修飾,兩者在從頭甲基化過程中發(fā)揮協(xié)同作用[20].Hsieh[21]分析比較了Dnmt1和Dnmt3a的作用發(fā)現(xiàn),Dnmt1可以催化組上瞬時(shí)出現(xiàn)的單鏈DNA(如起始區(qū))的局部位點(diǎn)發(fā)生從頭甲基化并向周圍擴(kuò)布,也可以被甲基化的CpG島底物所激活.而Dnmt3a則不能催化單鏈DNA底物發(fā)生甲基化,也不被甲基化的CpG島所激活.這表明盡管兩者都具有從頭甲基化活性,但是作用機(jī)制卻是完全不同的.在從頭甲基化過程中Dnmt3a扮演啟動始發(fā)的作用,他啟動雙鏈DNA中的其中一條鏈發(fā)生從頭甲基化,形成的半甲基化位點(diǎn)激活Dnmt1完成后續(xù)的從頭甲基化和維持甲基化修飾.深入研究發(fā)現(xiàn),Dnmt1可以催化未修飾的DNA發(fā)生甲基化,他的從頭甲基化Rheeetal[25]通過同源重組將Dnmt1除后發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性明顯下降,然而組甲基化程度卻只下降了20%左右,p16等很多仍處于甲基化致轉(zhuǎn)錄失活的狀態(tài).Dnmt1與Dnmt3b的共同滅活則幾乎消除了甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性,組DNA甲基化程度減少了95%以上,p16重新表達(dá),腫瘤,等.Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b和HMT在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)及意

[26].Leuetal應(yīng)用

embryoniclethality.Cell1992;69:915-

和Dnmt3b在癌細(xì)胞CP70中的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn),單獨(dú)抑制Dnmt1能部分消除目的(TWIST,RASSF1A,HIN-1)的高甲基化狀態(tài)并誘導(dǎo)表達(dá),單獨(dú)下調(diào)nmt3b的去甲基化和,甲基化應(yīng),目的的達(dá)增加7-15倍.ingetal28,RNA干擾技術(shù)下調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞中Dnmt1的表達(dá),細(xì)胞組CpG島甲基化模式仍然能夠得.,nt不同成員在細(xì)胞中并不單獨(dú)發(fā)揮作用,他們在維持DNA甲基化和甲基化致沉默過程中協(xié)同作用,共同發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng).此外,DNA甲基化酶()與組蛋白甲基化酶T)之間也可能存在著協(xié)同作用29-0],DNACpG島甲基化與組蛋白3甲基化在異染色質(zhì)形成與沉默過程中共同發(fā)揮作用,新發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基化酶()TBET與甲基化酶尤其是從頭甲基化酶Dnmt3a和Dnmt3b之間在功能上有密切的關(guān)聯(lián),nt1之間沒有關(guān)系[1].然而Espadaetal,Dnmt13位點(diǎn)正常甲.總之,我們的研究發(fā)現(xiàn),Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和HMT在結(jié)腸癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)不等的表達(dá)水平,Dnmt3a、Dnmt3b在分化良好的結(jié)腸癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)過度表達(dá)狀況而在分化不良或未分化的癌細(xì)胞則被抑制表達(dá)這提示表遺傳學(xué)用和份量可能并不相同不同分期與分化程度的生機(jī)制.此外,既然癌低甲基化與抑癌高甲基化在組織中是個(gè)普遍,那么要的靶點(diǎn)和方向.下一步在此實(shí)驗(yàn)資料基ChungYG,RatnamS,ChailletJR,LathamKE.AbnormalregulationofDNAmethyltransferaseexpressioninclonedmouseembryos.BiolReprod2003;69:146-153LiE,BestorTH,JaenischR.TargetedmutationoftheDNAmethyltransferasegeneresultsin

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本文選題新穎資料合適,數(shù)據(jù)可靠,結(jié)論客觀,文章的科學(xué)性創(chuàng)新性和可讀性較好的反映了我國結(jié)腸癌表現(xiàn)遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究的先進(jìn)ISSN1009- CN14-世 消 第4hypermethylationinhumancolorectaltumorsisnotassociatedwithDNAmethyltransferaseoverexpression.CancerRes1999;59:2302-2306OueN,KuraokaK,KuniyasuH,YokozakiH,WakikawaA,MatsusakiK,YasuiW.DNAmethylationstatusofhMLH1,p16(INK4a),andCDH1isnotassociatedwithmRNAexpressionlevelsofDNAmethyltransferaseandDNAFatemiM,HermannA,GowherH,JeltschA.Dnmt3aandDnmt1functionallycooperateduringdenovomethylationofDNA.EurJBiochem2002;269:4981-4984HsiehCL.ThedenovomethylationactivityofDnmt3aisdistinctlydifferentthanthatofDnmt1.BMCBiochem2005;6:6GowherH,StockdaleCJ,GoyalR,FerreiraH,Owen-HughesT,JeltschA.DenovomethylationofnucleosomalDNAbythemlianDnmt1andDnmt3ADNAmethyltransferases.Biochemistry2005;44:9899-9904AraujoFD,CroteauS,SlackAD,MilutinovicS,BigeyP,PriceGB,Zannis-HadjopoulosM,SzyfM.TheDNMT1targetrecognitionresidesintheNterminus.JBiolChem2001;276:6930-6936FatemiM,HermannA,PradhanS,JeltschA.TheactivityofthemurineDNAmethyltransferaseDnmt1iscontrolledbyinctionofthecatalyticwiththeN-terminalpartoftheenzymeleadingtoanallostericactivationoftheenzymeafterbindingtomethylatedDNA.JMolBiol2001;309:1189-1199RheeI,JairKW,YenRW,LengauerC,HermanJG,KinzlerKW,VogelsteinB,BaylinSB,SchuebelKE.CpGmethylationismaintainedinhumancancercellslackingDNMT1.Nature2000;404:1003-1007RheeI,BaanKE,ParkBH,JairKW,Yen

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