動物細(xì)胞培養(yǎng)

動物細(xì)胞培養(yǎng)第1頁/共97頁4.1培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征4.1.1體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型按生長方式分為3型：貼壁型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。半貼壁型細(xì)胞2

牛牛文庫文檔分享第2頁/共97頁（一）貼附型細(xì)胞：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞貼附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式結(jié)果:基于貼附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長。培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼附型細(xì)胞貼附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞

牛牛文庫文檔分享第3頁/共97頁細(xì)胞在體內(nèi)、外的貼附方式存在差異體內(nèi)：貼附是全方位,外形具有復(fù)雜的立體特征體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為四大類型

牛牛文庫文檔分享第4頁/共97頁1、成纖維細(xì)胞型：

牛牛文庫文檔分享第5頁/共97頁名稱：成纖維細(xì)胞來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織真正的成纖維細(xì)胞：心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長短不等的突起，中有卵圓形核生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞-細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起

牛牛文庫文檔分享第6頁/共97頁2、上皮細(xì)胞型

牛牛文庫文檔分享第7頁/共97頁名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核生長特點(diǎn)：易相連成片，相靠—緊密相連成薄層—鋪石狀生長時(shí)呈膜狀移動，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動

牛牛文庫文檔分享第8頁/共97頁3、游走細(xì)胞型：

呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。4、多形型細(xì)胞：

有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

牛牛文庫文檔分享第9頁/共97頁（二）懸浮型細(xì)胞：見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。來源：血，脾或骨髓，血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長良好，細(xì)胞圓形、單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：純化不方便，不能通過離心將死、活細(xì)胞分離

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牛牛文庫文檔分享第11頁/共97頁4.1.2培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)1.貼附貼壁→伸展影響因素：鈣離子機(jī)械、物理因素生物因素12

牛牛文庫文檔分享第12頁/共97頁細(xì)胞貼壁過程

牛牛文庫文檔分享第13頁/共97頁142.接觸抑制細(xì)胞接觸→停止移動正常細(xì)胞成單層生長腫瘤細(xì)胞無接觸抑制，可以堆積生長。接觸抑制可作為區(qū)分正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的標(biāo)志之一

牛牛文庫文檔分享第14頁/共97頁153.密度抑制細(xì)胞增殖，密度加大，培養(yǎng)液營養(yǎng)成分消耗，細(xì)胞代謝物增多，導(dǎo)致發(fā)生密度抑制，細(xì)胞分裂停止

牛牛文庫文檔分享第15頁/共97頁4.1.3培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程（一）單個(gè)細(xì)胞的生長過程（二）細(xì)胞系的生長過程（三）每代細(xì)胞的生長過程

牛牛文庫文檔分享第16頁/共97頁（一）單個(gè)細(xì)胞的生長過程細(xì)胞周期：一個(gè)母細(xì)胞分裂結(jié)束后形成的細(xì)胞到下一次再分裂結(jié)束形成兩個(gè)子細(xì)胞的時(shí)期。

牛牛文庫文檔分享第17頁/共97頁（二）細(xì)胞系的生長過程培養(yǎng)細(xì)胞的生命期：是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。包括原代培養(yǎng)期、傳代期及衰退期。

牛牛文庫文檔分享第18頁/共97頁細(xì)胞的生長曲線

牛牛文庫文檔分享第19頁/共97頁1．原代培養(yǎng)期：從體內(nèi)取出組織,接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（初代培養(yǎng)）特點(diǎn)：1-4周、細(xì)胞呈活躍的移動、可見細(xì)胞分裂、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上與體內(nèi)原組織相似性大、多呈二倍體核型細(xì)胞群是異質(zhì)的，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。

牛牛文庫文檔分享第20頁/共97頁2．傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。

牛牛文庫文檔分享第21頁/共97頁3．衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)，由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。

牛牛文庫文檔分享第22頁/共97頁細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。

牛牛文庫文檔分享第23頁/共97頁（三）每代細(xì)胞的生長過程所謂細(xì)胞的“一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代或倍增不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。

牛牛文庫文檔分享第24頁/共97頁細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：潛伏期指數(shù)生長期停止期25

牛牛文庫文檔分享第25頁/共97頁1．潛伏期游離:懸浮,胞質(zhì)回縮,全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形吸附:貼附底物,一般24小時(shí)內(nèi)貼壁潛伏:可有運(yùn)動活動,基本無增殖,少見分裂相

牛牛文庫文檔分享第26頁/共97頁2．指數(shù)生長期：細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。

細(xì)胞活力最旺盛的階段，培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細(xì)胞群體均一，是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞接觸抑制：細(xì)胞運(yùn)動停止密度抑制：細(xì)胞終止分裂

牛牛文庫文檔分享第27頁/共97頁3．停止期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停止期，也稱平臺期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡

牛牛文庫文檔分享第28頁/共97頁潛伏期指數(shù)生長期停止期

牛牛文庫文檔分享第29頁/共97頁4.1.4培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征（一）染色質(zhì)與染色體：正常細(xì)胞：二倍體細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化：多倍體或異倍體（二）細(xì)胞性別女性：Barr小體男性：Y小體

牛牛文庫文檔分享第30頁/共97頁4.1.5體內(nèi)外細(xì)胞的差異及培養(yǎng)細(xì)胞的分化經(jīng)多次傳代增殖后，培養(yǎng)細(xì)胞將失去原有的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化逐漸減弱或不顯。形態(tài)與功能逐漸單一化，細(xì)胞衰老或死亡，或發(fā)生轉(zhuǎn)化，獲得不死性或惡性性。

牛牛文庫文檔分享第31頁/共97頁4.2細(xì)胞培養(yǎng)液4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)常用液體1.水三蒸水、純水2.平衡鹽溶液（BSS）由生理鹽水發(fā)展而來，由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成。可維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子。主要用于合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液和洗滌組織、細(xì)胞等。Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎(chǔ)溶液。32

牛牛文庫文檔分享第32頁/共97頁33

牛牛文庫文檔分享第33頁/共97頁3.消化液胰蛋白酶EDTA-Na溶液膠原酶4.消化酶抑制液：用于終止消化酶的作用血清大豆胰酶抑制劑34

牛牛文庫文檔分享第34頁/共97頁5.培養(yǎng)基pH調(diào)整液：常用的有：3.7％、5.6％、7.4％的NaHCO3溶液和HEPES溶液（二羥乙基哌嗪乙烷磺酸）等。6.抗生素液：青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素7.谷氨酰胺補(bǔ)充液：谷氨酰胺在合成培養(yǎng)基中必須添加，它不穩(wěn)定，需及時(shí)補(bǔ)充。35

牛牛文庫文檔分享第35頁/共97頁4.2.2培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基的基本要求按照來源分：天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基36

牛牛文庫文檔分享第36頁/共97頁1.天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：直接取自動物體液或從組織中提取的天然成分作培養(yǎng)液，但成分復(fù)雜，來源有限。（1）血清：血漿去除纖維蛋白所得。營養(yǎng)豐富，其中溶有多種物質(zhì)，如無機(jī)鹽離子、蛋白質(zhì)及氨基酸、糖類（如葡萄糖等）、脂類、激素、固醇、抗體、維生素等。血清由于營養(yǎng)豐富，且含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)，能使細(xì)胞順利增殖生長，應(yīng)用最廣。缺點(diǎn)是組成復(fù)雜，使培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。常用新生犢牛血清和胎牛血清。37

牛牛文庫文檔分享第37頁/共97頁（2）胚胎提取液：雞胚、牛胚提取液，能促進(jìn)細(xì)胞生長。來源有限。不常用。（3）水解乳白蛋白：是乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解后的產(chǎn)物，含豐富氨基酸。用Hanks液配制成0.5%溶液，與合成培養(yǎng)基按比例混合使用。多用于細(xì)胞系和原代細(xì)胞的培養(yǎng)。（4）膠原：膠原是從動物真皮或大鼠尾腱中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長的作用。38

牛牛文庫文檔分享第38頁/共97頁2.合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是用化學(xué)物質(zhì)人工模擬合成，種類相當(dāng)多。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對實(shí)驗(yàn)條件的控制。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細(xì)胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清，稱為完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基，如109培養(yǎng)液、DMEM、TC199、RPMI-1640、MEM培養(yǎng)液等。39

牛牛文庫文檔分享第39頁/共97頁合成培養(yǎng)基的組成：（1）氨基酸：氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，12種必須氨基酸必須由培養(yǎng)液提供。需加一定量的谷氨酰胺。（2）維生素：包括水溶性和脂溶性兩類。一般由血清供應(yīng)。（3）無機(jī)離子：包括大量和微量無機(jī)離子，通常也可由血清提供。（4）碳源：以葡萄糖為主。（5）其他：嘌呤、嘧啶、輔酶及抗氧化劑等。40

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動物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未明確，后期對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測會造成一定困難。另外高質(zhì)量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。3.無血清培養(yǎng)基41

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無血清培養(yǎng)基不加動物血清，一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)液和替代血清的添加成分（細(xì)胞生長有效因子，激素等）兩部分組成?？杀ＷC實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。但成本較高，針對性較強(qiáng)，一種無血清培養(yǎng)基只適用于某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。主要用于：研究細(xì)胞生長因子、單克隆抗體的制備、以及細(xì)胞分泌產(chǎn)物研究42

牛牛文庫文檔分享第42頁/共97頁（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)液根據(jù)不同培養(yǎng)細(xì)胞選擇合適的合成培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。常用DMEM和F12以1：1比例混合作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用NaHCO3或HEPES溶液調(diào)整pH。43

牛牛文庫文檔分享第43頁/共97頁（2）補(bǔ)充成分激素和生長因子：激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、增殖刺激因子、類胰島素生長因子等。主要是刺激生長，維持細(xì)胞功能的作用。結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：主要是轉(zhuǎn)鐵蛋白（增強(qiáng)細(xì)胞攝取培養(yǎng)基中鐵的能力，可螯合痕量有害金屬離子）和白蛋白（參與運(yùn)載一些脂類、金屬離子等，也有螯合過量微量元素的作用）兩種蛋白。44

牛牛文庫文檔分享第44頁/共97頁貼壁和鋪展因子：幫助細(xì)胞貼壁和鋪展。如纖黏蛋白、血清鋪展因子、膠原等。微量元素和低分子量營養(yǎng)因子：硒元素、丁二胺、亞油酸等。酶抑制劑：常用大豆胰酶抑制劑。45

牛牛文庫文檔分享第45頁/共97頁46

牛牛文庫文檔分享第46頁/共97頁影響動物細(xì)胞培養(yǎng)的因素（1）溫度：哺乳動物最適溫度36.5±0.5℃；對低溫耐受性比高溫強(qiáng)。（2）pH：7.2～7.4之間。低于6.8或高于7.6細(xì)胞生長受到影響，甚至死亡。偏酸性耐受較強(qiáng)，偏堿性很快死亡。（3）氣體：O2；CO2，還可調(diào)節(jié)pH。（4）滲透壓：不同細(xì)胞要求不同。47

牛牛文庫文檔分享第47頁/共97頁4.3細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)定義動物細(xì)胞培養(yǎng)：就是將動物組織或細(xì)胞從機(jī)體中取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)的生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長和增殖的技術(shù)。體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。48

牛牛文庫文檔分享第48頁/共97頁動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的特點(diǎn):大多數(shù)須附著在固體或半固體的表面才能生長。對于營養(yǎng)要求苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清。對培養(yǎng)環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都需嚴(yán)格監(jiān)控。生長緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長，培養(yǎng)代價(jià)大污染問題難以控制。

牛牛文庫文檔分享第49頁/共97頁動物細(xì)胞的培養(yǎng)過程

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是動物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)

牛牛文庫文檔分享第50頁/共97頁轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)

牛牛文庫文檔分享第51頁/共97頁4.3.1原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。特點(diǎn)：原代細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生大變化，仍具有二倍體遺傳特性，最接近和反應(yīng)生物體內(nèi)生長特性，是藥物檢測、細(xì)胞分化的很好實(shí)驗(yàn)工具。原代細(xì)胞通常由多種細(xì)胞組成（異質(zhì)性），細(xì)胞獨(dú)立生存性差52

牛牛文庫文檔分享第52頁/共97頁過程

組織取材

組織細(xì)胞的分離培養(yǎng)機(jī)械法

消化法

牛牛文庫文檔分享第53頁/共97頁動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細(xì)胞懸液胰蛋白酶1代細(xì)胞原代培養(yǎng)50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）

牛牛文庫文檔分享第54頁/共97頁（一）組織取材1.雞胚組織：用于病毒與疫苗研究55

牛牛文庫文檔分享第55頁/共97頁2.鼠胚組織：與人最相近的哺乳動物組織，取材方便，易于培養(yǎng)。56⑥①②③④⑤

牛牛文庫文檔分享第56頁/共97頁機(jī)械法分離胚胎

牛牛文庫文檔分享第57頁/共97頁3.皮膚和粘膜：多來源于手術(shù)，需嚴(yán)格消毒以消滅細(xì)菌霉菌。4.血細(xì)胞：靜脈取血、指尖或耳垂取血。加肝素抗凝劑防止凝血。5.內(nèi)臟和實(shí)體瘤：主要源于外科手術(shù)和活檢組織。58

牛牛文庫文檔分享第58頁/共97頁59（二）組織細(xì)胞的分離有機(jī)械法和消化法兩大類1.機(jī)械法：離心分離法：適用于細(xì)胞懸液組織。500-1000rpm離心5-10min。切割分離法：用剪刀剪切成1mm3左右的小塊。機(jī)械分散法：擠壓和研磨，適用于纖維含量少的組織。

牛牛文庫文檔分享第59頁/共97頁60（二）組織細(xì)胞的分離2.消化法：可使組織疏松，細(xì)胞分開，細(xì)胞容易生長，成活率高。①胰蛋白酶消化法：適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，對傳代細(xì)胞也適用。使用濃度一般為0.1%-0.5%，用不含鈣、鎂離子的BSS配制，PH8-9。血清有抑制其活性作用。胰蛋白酶消化法有熱(37℃)和冷(4℃)兩種處理。

牛牛文庫文檔分享第60頁/共97頁

牛牛文庫文檔分享第61頁/共97頁62②膠原酶消化法：膠原酶是由細(xì)菌中提取出的酶，適用于消化纖維組織、上皮組織或膠原成分的組織?？捎煤}、鎂離子的BSS配制或溶于含血清的培養(yǎng)液中。使用濃度一般為0.1-0.3mg/mL，37℃溫育。優(yōu)點(diǎn)：消化緩和、無需機(jī)械振蕩缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴可與胰蛋白酶混用

牛牛文庫文檔分享第62頁/共97頁63③其他消化酶消化法：鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。④螯合劑消化法：常用螯合劑有檸檬酸鈉、EDTA-Na2等?？捎貌缓}、鎂離子的BSS配制成0.02%溶液。EDTA適于消化傳代細(xì)胞，不受血清抑制，消化后需徹底清洗。

牛牛文庫文檔分享第63頁/共97頁64（三）培養(yǎng)方法1.組織塊培養(yǎng)法：簡便，成功率較低

牛牛文庫文檔分享第64頁/共97頁2.單層細(xì)胞培養(yǎng)法:將解離得到的細(xì)胞用培養(yǎng)液配制成一定密度的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)。3.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法：指細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖的培養(yǎng)方法。少數(shù)動物細(xì)胞（血液和淋巴組織細(xì)胞等非貼壁動物細(xì)胞）可懸浮生長，采集組織分散、過濾、離心、純化、漂洗后接種培養(yǎng)。

牛牛文庫文檔分享第65頁/共97頁4.3.2傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)類型:非貼壁培養(yǎng)：也叫懸浮培養(yǎng)。用于血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等的培養(yǎng)，可在培養(yǎng)液中懸浮生長。貼壁培養(yǎng)：大多數(shù)動物細(xì)胞需貼附于帶適量正電荷的固體或半固體表面進(jìn)行培養(yǎng)。66

牛牛文庫文檔分享第66頁/共97頁67

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貼壁生長細(xì)胞的傳代（消化法）：要求細(xì)胞覆蓋80%以上吸出舊的培養(yǎng)液。用不含鈣、鎂離子的BSS溶液清洗。加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液解離細(xì)胞。2-5min檢查，如有細(xì)胞間隙變大，加入蛋白酶抑制劑或血清培養(yǎng)液終止消化。離心，棄上清液，加入Hanks液漂洗兩次。吸管輕輕吹打，加入新鮮培養(yǎng)液，制成懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整其密度。重新接種培養(yǎng)。

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牛牛文庫文檔分享第69頁/共97頁2.

半懸浮生長細(xì)胞的傳代

消化法或直接吹打法3.懸浮生長細(xì)胞傳代

離心法：培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管，1000r/min離心。棄上清液，沉淀細(xì)胞加新培養(yǎng)液混勻傳代。

牛牛文庫文檔分享第70頁/共97頁4.3.3常用培養(yǎng)技術(shù)1.懸滴培養(yǎng)：又稱植塊懸滴培養(yǎng)法，1907年由哈里森首創(chuàng)。即將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛于蓋玻片下，再置于一凹形載玻片上，最后用熔蠟密封后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：1）容易換片。

2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中，不需移動位置，有利于組織分化。71

牛牛文庫文檔分享第71頁/共97頁2.培養(yǎng)瓶培養(yǎng)：指將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)了卡氏瓶。采用的材料對細(xì)胞無毒，透明

牛牛文庫文檔分享第72頁/共97頁懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶滾動培養(yǎng)瓶貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶

牛牛文庫文檔分享第73頁/共97頁蓋玻片+培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：先以蓋玻片為生長表面，將擬培養(yǎng)細(xì)胞或組織接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：1）可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存3）增加了培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積。

牛牛文庫文檔分享第74頁/共97頁3.旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)：蓋爾（Gey，1933年）、劉易斯（Lewis，1934年）建立該方法。特點(diǎn)：是培養(yǎng)中組織塊或細(xì)胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸，有利于物質(zhì)交換和細(xì)胞生長。缺點(diǎn)：不易在顯微鏡下觀察。

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牛牛文庫文檔分享第76頁/共97頁774.克隆培養(yǎng)法：又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，就是將細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞株

:由細(xì)胞系進(jìn)一步克隆化，而獲得的由單一細(xì)胞形成的細(xì)胞群體。

初代細(xì)胞和有限細(xì)胞系的克隆培養(yǎng)比較困難，無限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞等則比較容易

牛牛文庫文檔分享第77頁/共97頁提高克隆形成率的措施：合理安排接種的密度（＜10個(gè)細(xì)胞/ml）使用克隆培養(yǎng)基（Ham12K培養(yǎng)液）使用同源細(xì)胞的條件培養(yǎng)液在培養(yǎng)中加入胎牛血清或其他添加劑、激素和生長因子將祖細(xì)胞接種到飼養(yǎng)細(xì)胞層或其他可適應(yīng)的生長基質(zhì)表面78

牛牛文庫文檔分享第78頁/共97頁條件培養(yǎng)液：已經(jīng)培養(yǎng)過某種細(xì)胞的培養(yǎng)液（內(nèi)含該細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)，包括少量生長因子）與一定比例新鮮培養(yǎng)液混合的培養(yǎng)液。可促進(jìn)與支持其他種細(xì)胞的生長。飼養(yǎng)細(xì)胞：也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過射線照射或裂霉素C作用后失去分裂能力，供其他細(xì)胞附著的細(xì)胞層。能促進(jìn)克隆細(xì)胞的生長，利于克隆的形成。79

牛牛文庫文檔分享第79頁/共97頁克隆培養(yǎng)技術(shù)：1.稀釋鋪板法2.飼養(yǎng)層克隆法3.膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法4.瓊脂克隆法5.多孔塑料培養(yǎng)板單細(xì)胞克隆法80

牛牛文庫文檔分享第80頁/共97頁815.細(xì)胞同步化培養(yǎng)：用自然的或人工的方法獲得細(xì)胞周期同步化的細(xì)胞群體。篩選同步化細(xì)胞誘導(dǎo)同步化細(xì)胞M期細(xì)胞震蕩脫落法離心洗脫法梯度沉降法血清饑餓法異亮氨酸營養(yǎng)缺乏法DNA合成抑制劑阻斷法秋水仙素阻斷法

牛牛文庫文檔分享第81頁/共97頁6.動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

牛牛文庫文檔分享第82頁/共97頁分批式操作流加式操作半連續(xù)式操作連續(xù)式操作灌流式操作優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。缺點(diǎn)：費(fèi)用高，每一次收液后，都要進(jìn)行一系列新的接種放大 的準(zhǔn)備工作，此期間生產(chǎn)停工。而且收液率低.優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)效率高，可反復(fù)長期培養(yǎng)，反復(fù)收獲產(chǎn)品。優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下 生長。缺點(diǎn)：開放式操作，容易造成污染。細(xì)胞容易發(fā)生變異，且對 設(shè)備等要求高。優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長。產(chǎn)量高等.6.動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

牛牛文庫文檔分享第83頁/共97頁4.4細(xì)胞系和細(xì)胞株的建立84細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞稱為細(xì)胞系。分為有限細(xì)胞系、無限細(xì)胞系。細(xì)胞株

:由細(xì)胞系進(jìn)一步克隆化，而獲得的由單一細(xì)胞形成的細(xì)胞群體。

牛牛文庫文檔分享第84頁/共97頁二倍體細(xì)胞：細(xì)胞群染色體數(shù)目與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75％或80％以上）的細(xì)胞群。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。為保持二倍體細(xì)胞能長期被利用，一般在初代或2～5代即大量凍存作為原種。遺傳缺陷細(xì)胞：從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺陷細(xì)胞。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。85

牛牛文庫文檔分享第85頁/共97頁腫瘤細(xì)胞系或株：是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。86

牛牛文庫文檔分享第86頁/共97頁細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名

HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）

CHO：中國地鼠卵巢細(xì)胞（ChineseHamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／mL。

牛牛文庫文檔分享第87頁/共97頁細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用

ATCC入庫細(xì)胞要求檢測項(xiàng)目如下：

培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等

凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱

細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性

培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量

牛牛文庫文檔分享第88頁/共97頁細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長特性

核型：二倍體或多倍體