蛋白質(zhì)測定-凱氏定氮法

【基礎(chǔ)知識】蛋白質(zhì)概述蛋白質(zhì)是食品營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)，含N是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近，一般來說，pro的平均含氮量為16%，即一份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。注意：不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、青豆、雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70、全小麥、大麥、燕麥、裸麥和小米是5.83；硬果類為5.30；牛乳及其制品為6.38。第一頁，共21頁。【一、實驗?zāi)康摹?、掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2、學(xué)會使用凱氏定氮裝置。3、了解蛋白質(zhì)系數(shù)在蛋白質(zhì)含量計算中的應(yīng)用。蛋白質(zhì)是食品營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。測量食品中蛋白質(zhì)的含量對于評價食品的營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利用食品資源、指導(dǎo)生產(chǎn)、優(yōu)化食品配方、提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的意義。第二頁，共21頁。

注意：此法測定得到的蛋白質(zhì)含量，實際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為粗pro?！径?、原理】第三頁，共21頁。1、消化儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：【三、實驗步驟】第四頁，共21頁。試劑作用硫酸銅a催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解。b消化完全的指示劑：藍(lán)綠色，澄清，透明；c蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀硫酸鉀提高溶液沸點，從而加快有機(jī)物分解濃硫酸氧化作用：有機(jī)物質(zhì)氧化分解為H2O和CO2樣品預(yù)處理固體試樣0.2~2g半固體試樣2~5g液體試樣10~25g樣品充分混勻直接消化第五頁，共21頁。樣品稱量、消化1.000g奶粉0.2g硫酸銅6g硫酸鉀20mL濃硫酸玻璃珠小火加熱炭化至泡沫完全停止輕搖大火加熱保持瓶中液體微沸至藍(lán)綠色澄清透明繼續(xù)加熱0.5～1h冷卻加20mL水冷卻同時做試劑空白試驗第六頁，共21頁。第七頁，共21頁。2、蒸餾、吸收儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：100mL3只試劑（混合指示劑）：2份甲基紅乙醇液（1g/L）與1份亞甲基藍(lán)乙醇液（1g/L）臨用時混合。指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。第八頁，共21頁。凱氏定氮蒸餾裝置傳統(tǒng)裝置1：電爐2：水蒸氣發(fā)生器3：螺旋夾4：小玻杯及棒狀玻塞5：反應(yīng)室6：反應(yīng)室外層7：橡皮管及螺旋夾8：冷凝管9：蒸餾液接收瓶第九頁，共21頁。水蒸氣發(fā)生器：裝水至2/3處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)ml，使水呈微紅色（保持酸性以防水中氨的逸出）→按上圖所示搭好裝置第十頁，共21頁。蒸餾及吸收10.0mL硼酸溶液→100mL三角瓶→加1～2滴混合指示劑冷凝管下端插入三角瓶液面下→準(zhǔn)確吸取10mL試樣→由小玻杯流入反應(yīng)室→少量水洗滌小漏斗→蓋緊玻璃塞→量筒取10.0mLNaOH溶液→倒入小玻杯→提起玻塞使其緩慢流入反應(yīng)室→立即塞緊玻璃塞→加水于小玻杯防漏氣通蒸汽→顏色變化時開始計時蒸餾5min→移動接受瓶使液面離開冷凝管下端→再蒸餾1min→用少量水沖洗冷凝管下端外部→取下接收瓶第十一頁，共21頁。[注意]①加NaOH一定要過量，此時溶液生成深藍(lán)色或黑色沉淀②為防止樣液中氨氣逸出。一是要水封，二要夾緊廢液蝴蝶夾后再通蒸汽，三要注意接頭處有無松漏現(xiàn)象硼酸吸收液的顏色反應(yīng)室中溶液的顏色第十二頁，共21頁。③冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。吸收液溫度不應(yīng)超過40℃，避免氨氣逸出，若超過時可置于冷水浴中使用。④在蒸餾時，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得?；饠嗥?否則會發(fā)生倒吸。⑤蒸餾完畢后，先將冷凝管下端離開液面，再蒸1分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。⑥所用的試劑溶液必須用無氨蒸餾水配制。第十三頁，共21頁。3、鹽酸滴定接收瓶以HCL標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定灰色終點記錄VHcl（1）硼酸吸收液的顏色（2）吸收氨氣后的硼酸吸收液的顏色（3）鹽酸滴定終點的顏色第十四頁，共21頁。項目名稱檢測日期樣品名稱檢驗依據(jù)內(nèi)容123空白樣品質(zhì)量m/gV初/mLV終/

mL消耗的體積V1/mL吸取消化液體積V3/mL蛋白質(zhì)含量（g/100g）平均值（g/100g）（g/100g）F：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.38【四、數(shù)據(jù)記錄與計算】第十五頁，共21頁。有效數(shù)字：蛋白質(zhì)含量≥1g/100g時，結(jié)果保留三位有效數(shù)字蛋白質(zhì)含量＜1g/100g時，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。精密度：在重復(fù)性條件下的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%（g/100g）第十六頁，共21頁。小結(jié)步驟反應(yīng)前后顏色變化濕法消化凱氏燒瓶：樣品無色（加硫酸前）→加硫酸炭化黑色→消化后紅棕色→棕褐色→消化終點藍(lán)綠色/墨綠色→淡藍(lán)色（冷卻后溶液）堿化蒸餾反應(yīng)室：深藍(lán)色或黑色沉淀硼酸吸收紫紅色→綠色鹽酸滴定甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色→灰色甲基紅和亞甲基藍(lán)混合液：綠色→藍(lán)紫色第十七頁，共21頁。凱氏定氮法用于所有動物、植物類食品的蛋白質(zhì)含量的測定，但因樣品中含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測定結(jié)果為粗蛋白質(zhì)含量。若要測定樣品的蛋白氮,則需要向樣品中加入三氯乙酸溶液,使其最終濃度為5%,然后測定未加入三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量,進(jìn)一步計算出蛋白質(zhì)含量:

蛋白氮=總氮-非蛋白氮第十八頁，共21頁。準(zhǔn)確稱取某乳粉樣品0.800克，經(jīng)凱氏法消化定容至100ml，移取5ml消化液進(jìn)行蒸餾，用20ml硼酸吸收，再用0.05000mol/lHCl滴定，結(jié)果消耗5.00ml，試計算該乳粉的蛋白質(zhì)含量？試述蛋白質(zhì)測定中，樣品消化過程所必須注意的事項，消化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？樣品經(jīng)消化進(jìn)行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時溶液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說明什么問題？須采用什么措施？第十九頁，共21頁。知識拓展：三聚氰胺假蛋白“原理”三聚氰胺的“優(yōu)點”1、普通蛋白質(zhì)含氮量平均為16%，一般不超過30%，而三聚氰胺含氮量為66.7％。2、三聚氰胺為白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，但是尿素等卻有氣味，摻入后容易被檢測出來若以合格奶粉蛋白質(zhì)含量為18%計算，則含氮量為2.88%。三聚氰胺含氮量是牛奶的15