基因突變和基因組

基因突變指一個基因中的DNA改變，最終造成遺傳多樣性第一頁，共81頁。10.1基因突變種類堿基對改變(點突變)轉(zhuǎn)座因子第二頁，共81頁。10.1.1堿基對改變?nèi)绻粋€基因上原來的一個堿基對被另一個堿基對取代，稱為點突變置換（同義突變、錯義突變、無義突變）插入或缺失（移碼突變）第三頁，共81頁。1、置換

同義突變錯義突變無義突變第四頁，共81頁。同義突變（samesensemutation）堿基被替換之后，產(chǎn)生了新的密碼子，但新舊密碼子同義，所編碼的氨基酸種類保持不變，因此同義突變并不產(chǎn)生突變效應(yīng)。第五頁，共81頁。錯義突變（missensemutation）堿基替換使編碼某種氨基酸的密碼子變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變。第六頁，共81頁。無義突變（non-sensemutation）堿基替換使編碼氨基酸的密碼變成終止密碼UAA、UAG或UGA。T代替G第七頁，共81頁。2、插入或缺失移碼突變第八頁，共81頁。根據(jù)基因突變發(fā)生的原因，可將突變分為：自發(fā)突變和誘發(fā)突變在自然條件下，未經(jīng)人工處理而發(fā)生的突變?yōu)樽园l(fā)突變經(jīng)人工處理而發(fā)生的突變是誘發(fā)突變3、突變的誘發(fā)第九頁，共81頁。誘變劑能誘發(fā)基因突變的各種內(nèi)外環(huán)境因素統(tǒng)稱為誘變劑（mutagen）物理誘變劑：各種射線等化學(xué)誘變劑第十頁，共81頁。紫外線誘發(fā)的胸腺嘧啶二聚體T-AT-T第十一頁，共81頁。常見的化學(xué)誘變劑有：堿基類似物：以假亂真如：5-Bu(酮式與T結(jié)構(gòu)相似，烯醇式與G結(jié)構(gòu)相似)，可以置換T或G丫啶類染料、氮芥類衍生物：造成DNA增加一、二個堿基，引起移碼突變亞硝酸或烷化劑:可以改變核酸中核苷酸化學(xué)組成

第十二頁，共81頁。HNO2第十三頁，共81頁。10.1.2轉(zhuǎn)座因子第十四頁，共81頁。麥克林托克在某些玉米籽粒中發(fā)現(xiàn)玉米籽粒顏色的遺傳很不穩(wěn)定，有時籽粒上還出現(xiàn)一些斑斑點點。她通過耐心的記錄和仔細(xì)的分析，發(fā)現(xiàn)使籽粒著色的色素基因是在某一特定帶上“接上”或“拉斷”的。第十五頁，共81頁。解離因子(Ds,Dissociation)抑制紅、紫顏色的產(chǎn)生激活因子(Ac,Activator)

使顏色產(chǎn)生麥克林托克花了6年時間(1944—1950)發(fā)現(xiàn)玉米的“Ds-Ac調(diào)控系統(tǒng)”第十六頁，共81頁。1951年，在冷泉港生物學(xué)專題討論會上，麥克林托克遞交了自己的學(xué)術(shù)論文，向科學(xué)界同行報告了她的新理論。她提出遺傳基因可以轉(zhuǎn)移，能從染色體的一個位置跳到另一個位置，甚至從一條染色體跳到另一條染色體上。她把這種能自發(fā)轉(zhuǎn)移的遺傳基因稱為“轉(zhuǎn)座因子”。

“轉(zhuǎn)座因子”除了具有跳動的特性之外，還具有控制其他其因開閉的作用，因此“轉(zhuǎn)座因子”又可叫做“控制因子”。第十七頁，共81頁。巴巴拉·麥克林托克的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時幾乎不被科學(xué)界所接受直到20世紀(jì)60年代末，美國細(xì)菌學(xué)家J.Shapiro夏皮羅在研究大腸桿菌乳糖操縱子時，發(fā)現(xiàn)有一類可以移動的因子，會導(dǎo)致基因的插入失活和自主恢復(fù)活性，從而確認(rèn)了轉(zhuǎn)座因子的存在1983年，巴巴拉·麥克林托克榮獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。第十八頁，共81頁。轉(zhuǎn)座子可以分為兩大類：以DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子第一類轉(zhuǎn)座子可以通過DNA復(fù)制或直接切除兩種方式獲得可移片段，重新插入基因組DNA中。第十九頁，共81頁。根據(jù)轉(zhuǎn)座的自主性，這類元件又可以分為自主轉(zhuǎn)座元件和非自主轉(zhuǎn)座元件，前者本身能夠編碼轉(zhuǎn)座酶而進行轉(zhuǎn)座，后者則需在自主元件存在時方可轉(zhuǎn)座，以玉米的Ac/Ds體系為例：Ac(Activator)屬于自主元件，Ds(Dissociation)則是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能轉(zhuǎn)座第二十頁，共81頁。轉(zhuǎn)座插入可引起插入突變、新基因產(chǎn)生及染色體畸變等遺傳學(xué)效應(yīng)基因組中DNA轉(zhuǎn)座不僅可用于解釋染色體缺失、倒位等遺傳現(xiàn)象，而且還可用于構(gòu)建新的突變株第二十一頁，共81頁。在幾乎所有物種中都發(fā)現(xiàn)了與轉(zhuǎn)座子相關(guān)的序列如人類中的Alu（阿奴）因子第二十二頁，共81頁。人的Alu因子約占人基因組10%，由300bp構(gòu)成基本單位，在每個細(xì)胞中約有數(shù)十萬拷貝Alu因子比絕大多數(shù)功能性轉(zhuǎn)座因子短得多，不編碼任何蛋白質(zhì)人的DNA中，由于Alu因子轉(zhuǎn)座插入，可導(dǎo)致血友病和家族性高膽固醇血癥等發(fā)生一種罕見的人類神經(jīng)紊亂疾病—腿和腳的肌肉以及神經(jīng)逐漸退化疾病，是由類似果蠅的轉(zhuǎn)座因子Mariner插入17號染色體所致第二十三頁，共81頁。10.2脫離正常軌道的細(xì)胞—癌細(xì)胞第二十四頁，共81頁。在動物和人體中，由于細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)失控而無限增殖的細(xì)胞稱為腫瘤細(xì)胞惡性腫瘤是指具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞離開原來的部位，擴散到新的組織、器官形成的新的腫瘤第二十五頁，共81頁。癌細(xì)胞的主要特征能自身提供充足的生長信號對抑制/抗生長信號不敏感能逃避細(xì)胞凋亡有無限復(fù)制的潛能能支持癌中新血管生長發(fā)生組織侵染和轉(zhuǎn)移第二十六頁，共81頁。致癌因子

物理化學(xué)生物第二十七頁，共81頁。致癌基因在1911年Rous發(fā)現(xiàn)能使鳥類結(jié)締組織長出腫瘤的病毒，按發(fā)現(xiàn)者的名字命名，為勞氏肉瘤病毒（RSV，發(fā)現(xiàn)者，1879—1970，1966年獲諾貝爾獎）在致癌病毒中找到與致癌直接相關(guān)的基因，稱癌基因，RSV中的癌基因定名為src基因。第二十八頁，共81頁。src表達產(chǎn)物是酪氨酸激酶，可使細(xì)胞中蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，使蛋白質(zhì)構(gòu)型和功能改變，從而造成正常細(xì)胞癌變進一步研究發(fā)現(xiàn)，未感染的寄主細(xì)胞中，用分子雜交技術(shù)也能找到與病毒癌基因相近的核苷酸序列，稱為細(xì)胞癌基因（c-src），或原癌基因來自病毒的稱病毒癌基因(v-src)第二十九頁，共81頁。原癌基因如何變成癌基因轉(zhuǎn)座或易位基因擴增點突變造成過度表達，或表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)活性失控，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，向癌變方向發(fā)展第三十頁，共81頁。腫瘤抑制基因P53—抑癌基因P53表達產(chǎn)物是與專一性DNA結(jié)合的核蛋白P53可通過將細(xì)胞阻斷于G1期而抑制細(xì)胞生長在某些細(xì)胞類型中誘發(fā)細(xì)胞凋亡P53基因是人類腫瘤相關(guān)基因中突變頻率最高的基因第三十一頁，共81頁。10.3人類基因組計劃（HGP）1986年，美國Dulbecco在《Science》上發(fā)表的一篇題為“癌癥研究的轉(zhuǎn)折點：人類基因組測序”的短文認(rèn)為：要弄清癌癥的發(fā)生、演進、侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，必須對人的基因組進行全序列測定；并認(rèn)為這樣大的項目必須通過國際協(xié)作共同完成他的建議很快得到科學(xué)界的贊同和美國有關(guān)部門支持第三十二頁，共81頁。1990年正式啟動，預(yù)計15年時間，投資30億美元。美、英、法、德、日、中六國，我國是唯一的發(fā)展中國家，完成1%的測序工作（3號染色體3千萬個堿基對）2000年6月公布草圖，2003年完成。第三十三頁，共81頁。1998年5月11日，世界上最大的測序儀生產(chǎn)商美國PEBiosystems公司，以其剛研制成功的300臺最新毛細(xì)管自動測序儀（ABI3700）和3億美元資金，成立了CeleraGenomics公司，宣稱要在3年內(nèi)，以所謂的“人類全基因組霰彈法測序策略”完成人類基因組測序，并聲稱要專利200～400個重要基因，并將所有序列信息保密3個月。Celera公司已有雇員300多人，購買了號稱“全球第三”的超大型計算機，號稱擁有了超過全球所有序列組裝解讀力量總和的實力。就在六國共同宣布工作框架圖構(gòu)建完成的同一天，Celera公司宣稱已組裝出了完整的人類遺傳密碼。Celera公司此舉，是對公益性的HGP的競爭與挑戰(zhàn)第三十四頁，共81頁。基因組（genome）：一個生物體的全部基因序列最簡單的生物如SV40病毒的基因組僅含有5100堿基對（basepairbp）大腸桿菌基因組的大小為5700千堿基對（kbp）人的基因組則由大約3.0×109個bp組成第三十五頁，共81頁。人類共有2.5萬個基因或更少（原先估計5～10萬）是原核生物平均基因數(shù)的5～15倍人平均基因長度27000bp，而原核生物基因約1000bp經(jīng)典分子生物學(xué)認(rèn)為一個基因只能表達一種蛋白質(zhì)，而人體中存在著非常復(fù)雜繁多的蛋白質(zhì)，提示一個基因可以編碼多種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)比基因具有更為重要的意義第三十六頁，共81頁。人類基因組的構(gòu)成

第三十七頁，共81頁。假基因(pseudogene):具有與功能基因相似的序列，但由于有許多突變以致失去了原有的功能，所以假基因是沒有功能的基因，常用ψ表示。間隔區(qū)是指基因間不編碼的部分，間隔區(qū)常常含有轉(zhuǎn)錄的啟動子和其它上游調(diào)節(jié)序列。內(nèi)含子是指基因內(nèi)部不編碼的區(qū)域，也稱間插序列.在初始轉(zhuǎn)錄中存在此序列，但在加工后將被切除掉，所以常不作為翻譯的信息。有的內(nèi)含子也可以編碼，如成熟酶和內(nèi)切酶等。第三十八頁，共81頁。在人類基因組中：外顯子僅占1.5%，內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列占25%；基因外DNA間隔占74.5%，其中Alu序列就占10%(中度重復(fù)序列)第三十九頁，共81頁。10.4DNA操作技術(shù)DNA操作技術(shù)是當(dāng)今分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)基因工程技術(shù)是DNA操作技術(shù)的一部分第四十頁，共81頁?；蚬こ滩捎妙愃乒こ碳夹g(shù)的方法，在離體條件下將特定的基因或DNA序列插入載體中，構(gòu)成重組DNA，再把它導(dǎo)入特定的生物細(xì)胞中，使外源基因在其中復(fù)制表達，制造出大量基因和基因產(chǎn)物，并改變受體生物的性狀。第四十一頁，共81頁。過程1、目的基因的獲得及制取：限制性內(nèi)切酶2、基因載體的選取：質(zhì)粒、噬菌體3、DNA體外重組：連接酶4、DNA重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌5、重組體的篩選6、重組基因的表達基因工程的內(nèi)容第四十二頁，共81頁。基因克隆示意圖第四十三頁，共81頁。10.4.1目的基因的獲得及制取第四十四頁，共81頁。1目的基因獲得化學(xué)合成法基因組DNA文庫cDNA文庫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR第四十五頁，共81頁。基因組DNA文庫

利用分子克隆的方法，可以把某物種的全部DNA切割成大小合適的片段，并重組到合適的載體中，在合適的受體細(xì)胞中擴增，于是人們就可以方便的保存該物種的全部DNA稱為該物種的基因組文庫第四十六頁，共81頁。cDNA文庫如果把某組織或細(xì)胞中全部的mRNA變成DNA，再克隆到合適的載體上，就得到cDNA文庫。它涵蓋了該組織或細(xì)胞中表達的全部基因的編碼序列第四十七頁，共81頁。DNA多聚鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1985年由美國Millus創(chuàng)立PCR第四十八頁，共81頁。基因的擴增技術(shù)

——鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)5′3′3′5′5′3′3′5′+變性(94℃)復(fù)性(55℃)5′3′P13′5′+P2+P1P2合成（72℃）PCR經(jīng)60次循環(huán)，擴增倍數(shù)為109～1010第四十九頁，共81頁。操作步驟：1、加熱變性：將待擴增的DNA置于94～95℃的高溫水浴中加熱5分鐘，使雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA，分開的兩條單鏈作為擴增的模板。2、退火：將加熱變性的單鏈DNA溶液的溫度緩慢下降至55℃，在這過程中將引物的堿基與單鏈模板DNA一端堿基互補配對。3、延伸：在退火的過程中，當(dāng)溫度下降至72℃時，在耐熱性TaqDNA多聚酶、適當(dāng)?shù)膒H和一定的離子強度下，引物堿基和模板DNA結(jié)合延伸成雙鏈DNA。第五十頁，共81頁。

2制取

將所需的基因從DNA上切割下來，所用的“手術(shù)刀”－－限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶是存在于微生物體內(nèi)具有特異功能的酶類，是微生物作為區(qū)別自己與非己的DNA，近而降解非己的DNA分子的一種防衛(wèi)工具將之提取出來作為基因操作工具。第五十一頁，共81頁。限制性內(nèi)切酶特點：種類多極強的特異性，在特定的堿基順序位點上切開，出現(xiàn)兩種末端：粘性末端粘端

平頭末端平端第五十二頁，共81頁。10.4.2基因載體的選取外源基因不易進入宿主細(xì)胞，即使進入也難以進行復(fù)制和表達，往往會被宿主細(xì)胞的內(nèi)切酶系統(tǒng)降解掉。必須尋找合適的載體，將外源目的基因重組到載體DNA上，組成重組體，再利用載體的生物學(xué)特性導(dǎo)入宿主，完成復(fù)制和表達。第五十三頁，共81頁。主要載體為：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌人工染色體（BAC）、酵母人工染色體（YAC）不同載體運載外源DNA的大小不同質(zhì)粒載體一般在15kb以下噬菌體可容納25kbBAC可達100～500kbYAC可以插入250～2000kb的DNA片段第五十四頁，共81頁。細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物細(xì)胞中染色體以外的雙鏈閉合環(huán)狀分子。大小為1～200kb；能獨立于染色體外進行自我復(fù)制，每個細(xì)胞中可含10～200個拷貝。其表型效應(yīng)主要有決定抗藥性，合成抗菌素，編碼限制或修飾酶等染色體質(zhì)粒質(zhì)粒載體第五十五頁，共81頁。理想的質(zhì)粒

拷貝數(shù)多;兩三個抗藥性基因：terr，ampr作為

篩選標(biāo)志

合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點第五十六頁，共81頁。pBR322EcoRⅠHindⅢBamHⅠAvaⅠPvuⅡSalⅠPstⅠOri

EcoRI是從大腸桿菌菌株EcoRRY13中取得的第一種限制酶HindШ是從流感嗜血桿菌中取得的第三種限制酶氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因復(fù)制起點第五十七頁，共81頁。10.4.3DNA體外重組外源基因與載體的連接（DNA連接酶）連接方式：粘性末端連接連接效率高平端連接連接效率低第五十八頁，共81頁。第五十九頁，共81頁。第六十頁，共81頁。重組之后的外源DNA還必須回到細(xì)胞內(nèi)才能復(fù)制和表達，顯示出生物學(xué)活性。基因工程常用大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌為受體菌（宿主）10.4.4重組DNA導(dǎo)入受體菌

第六十一頁，共81頁。細(xì)菌質(zhì)粒常用的受體細(xì)胞是大腸桿菌將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程稱為轉(zhuǎn)化細(xì)菌只有在一定狀態(tài)下，才可接受外源DNA進入細(xì)胞，這種狀態(tài)稱為感受態(tài)受體細(xì)胞，如用氯化鈣或用蒸餾水處理后，再加電擊，細(xì)菌細(xì)胞膜會出現(xiàn)暫時性孔洞，成為能允許帶有外源DNA的載體進入的感受態(tài)細(xì)胞重組質(zhì)粒進入受體細(xì)胞的概率僅為1‰第六十二頁，共81頁。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入受體細(xì)胞后，還需要進行篩選鑒定，以挑出含有正確插入外源基因的重組體克隆，摒棄空的載體克隆10.4.5重組體的篩選第六十三頁，共81頁。培養(yǎng)基中加抗生素培養(yǎng)抗藥性標(biāo)志選擇第六十四頁，共81頁。藍白斑篩選由于許多載體的基因組中含有β-半乳糖苷酶基因lacZ，這種載體感染大腸桿菌后，會在大腸桿菌內(nèi)合成β-半乳糖苷酶IPTG（誘導(dǎo)物）（異丙基硫代--D-半乳糖苷）X-gal（顯色劑）（5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）深藍色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍。形成藍色菌落如果外源基因插入載體的位置阻斷了β-半乳糖苷酶基因lacZ的編碼序列，則見到無色菌落第六十五頁，共81頁。10.4.6克隆基因的表達表達載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件密碼子通用第六十六頁，共81頁。表達載體必須具備的條件：獨立地進行復(fù)制具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記具有很強的啟動子具有阻遏子具有很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號第六十七頁，共81頁。大腸桿菌表達體系的不足缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制缺乏翻譯后加工機制，不能折疊和糖基化融合蛋白形成包涵體(不溶的、無活性的)，復(fù)性后才有活性很難表達大量的可溶性蛋白第六十八頁，共81頁。包含體形成的原因

高水平表達時，新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白正確折疊的速率就會導(dǎo)致包含體的形成大腸桿菌中缺乏蛋白折疊過程中的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等第六十九頁，共81頁。包含體形成對于重組蛋白的優(yōu)勢：包含體具有高密度，易于分離純化抵御大腸桿菌中的蛋白酶對目的蛋白的降解對于生產(chǎn)那些天然構(gòu)像對宿主細(xì)胞有毒害作用的蛋白時，是最佳選擇第七十頁，共81頁。10.4.7轉(zhuǎn)基因動物將外源基因?qū)氲絼游矬w內(nèi)當(dāng)這種外源基因與動物本身的基因整合后，外源基因就能隨細(xì)胞的分裂而增殖在動物體內(nèi)表達出動物原來沒有的性狀并能傳給后代這種動物稱為轉(zhuǎn)基因動物第七十一頁，共81頁。1981年，美國的Brinster和Palmiter用小鼠進行了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炋卮笫笊L激素基因與小鼠的金屬硫蛋白的基因(MT)連在一起，構(gòu)成MTrGH基因然后用顯微注射法注射到小鼠受精卵中再移植入假孕鼠的子宮中，發(fā)育生長共產(chǎn)出21只小鼠其中7只帶外源基因，而6只體型較原小鼠大一倍左右即著名的轉(zhuǎn)基因超級小鼠

超級小鼠第七十二頁，共81頁。轉(zhuǎn)基因動物實驗研究方向1、培育抗逆、優(yōu)質(zhì)的動物新品種如：抗凍魚、高瘦肉率豬、高產(chǎn)奶牛等第七十三頁，共81頁。2、培育生產(chǎn)藥用蛋白或醫(yī)學(xué)研究模型的轉(zhuǎn)基因動物就基因藥物而言，最理想的的基因表達場所是乳腺，從乳汁中提取的目的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高且生物活性穩(wěn)定第七十四頁，共81頁。攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀钡谄呤屙摚?1頁。第七十六頁，共81頁。什么是“三親嬰兒”？人類的基因有99.8%由父母雙方共同提供，但有一小部分線粒體基因完全來自母方。線粒體只經(jīng)過母嬰遺傳，如果母方的這部分基因中若存在缺陷（例如身患肌肉萎縮癥），就會將其遺傳給下一代。而“線粒體替換”療法能夠借助第