第十六章色譜分析法概論

第十六章色譜分析法概論第一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日概述

色譜法是一種重要的分離、分析技術(shù)。

一、色譜法（起源）

1906年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（Tswett）首次研究了植物葉的色素成分。（如圖）分析過(guò)程為離線的，即不能連續(xù)進(jìn)行。人們將這種方法稱為色譜法，隨著色譜法的發(fā)展，可對(duì)大量無(wú)色物質(zhì)進(jìn)行分離，但仍沿用了色譜法這一名詞。第二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日

現(xiàn)代色譜法的分離、分析過(guò)程是在線的，即連續(xù)進(jìn)行。第三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日二、色譜法特點(diǎn)①分離效率高②選擇性好③集分離、分析于一體④靈敏度高（可測(cè)10-11—10-13g）⑤分析速度快⑥易與其它儀器聯(lián)用，應(yīng)用范圍廣第四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)色譜法的分類和發(fā)展一、色譜法的分類1.按兩相（固定相與流動(dòng)相）狀態(tài)分類氣相色譜法

色譜法液相色譜法超臨界色譜法

第五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日2.按分離原理分類

吸附色譜分配色譜色譜法離子交換色譜凝膠色譜（擴(kuò)散）、親和色譜、絡(luò)合色譜、熱色譜等第六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日3.按固定相形式分類填充柱色譜柱色譜色譜法毛細(xì)管色譜紙層色譜薄層色譜第七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日二、色譜法的發(fā)展㈠色譜法的歷史㈡色譜法的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)1.新型固定相和檢測(cè)器的研制2.色譜新方法的研究3.色譜聯(lián)用技術(shù)4.色譜專家系統(tǒng)第八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)色譜過(guò)程和基本原理一、色譜過(guò)程及色譜圖第九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日二、色譜流出曲線和有關(guān)概念㈠色譜流出曲線1.色譜流出曲線

當(dāng)試樣流經(jīng)色譜柱后，各組分隨流動(dòng)相的移動(dòng)而在兩相間反復(fù)進(jìn)行吸附、解吸、或分配、萃取過(guò)程，最后依次得到各組分，將各組分濃度經(jīng)檢測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)而記錄下來(lái)，得到一條信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線，稱為色譜流出曲線。第十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日2.基線

操作條件穩(wěn)定后，僅有流動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)隨時(shí)間變化的曲線。3.色譜峰（P339)4.色譜峰區(qū)域?qū)挾?/p>

它是組分在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，可反映出色譜柱的分離效能第十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日度量色譜峰區(qū)域?qū)挾瘸Ｓ萌N方法：①標(biāo)準(zhǔn)偏差σ

即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。②半峰寬W1/2

即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬W1/2=2.354σ③峰底寬Wb

即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距Wb=4σ第十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日㈡保留值

保留值是試樣各組分在色譜柱中保留行為的量度，可反映出組分與固定相間作用力大小。1.死時(shí)間t0

不被固定相吸附或溶解的組分，即非滯留組分（如空氣、甲烷）從進(jìn)樣開(kāi)始到出現(xiàn)其色譜峰最大值所需的時(shí)間。它也是氣體流經(jīng)色譜柱中空隙所需時(shí)間。第十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日2.保留時(shí)間tR

某組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)色譜峰最大值的時(shí)間。它取決于色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素，是定性依據(jù)。3.調(diào)整保留時(shí)間tR′

扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。它反映了組分與固定相作用所消耗的時(shí)間，是各組分產(chǎn)生差速遷移的物化基礎(chǔ)。第十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日4.死體積V0

指在t0這段時(shí)間內(nèi)通過(guò)色譜柱的載氣體積。即色譜柱內(nèi)載氣所占的體積。

V0=t0·Fc(

Fc，ml/min為流動(dòng)相流速)5.保留體積VR

指從進(jìn)樣到出現(xiàn)某組分色譜峰最大值時(shí)所通過(guò)的載氣體積。

VR=tR·Fc第十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日6.調(diào)整保留體積

VR′

指扣除死體積后的保留體積。

VR′=VR-V0=tR′·

Fc7.

相對(duì)保留值r2，1

指在相同操作條件下，某組分2的調(diào)整保留值與另一組分1的調(diào)整保留值之比。即第十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日

相對(duì)保留值僅與柱溫、固定相性質(zhì)有關(guān)?？捎脕?lái)表示色譜柱的選擇性。*r2，1↑，兩組分越易實(shí)現(xiàn)分離。*r2，1=1時(shí)，兩組分色譜峰重疊。第十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日8.保留指數(shù)I

在GC中，把組分的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保留行為，也就是以正構(gòu)烷烴系列作為組分相對(duì)保留值的標(biāo)準(zhǔn)，用兩個(gè)保留時(shí)間緊鄰待側(cè)組分的基準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)標(biāo)定組分，這個(gè)相對(duì)值稱為保留指數(shù)。第十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日㈢色譜峰高和峰面積1.峰高h(yuǎn)

是組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的檢測(cè)信號(hào)，即色譜峰頂至基線的距離。2.峰面積A

色譜曲線與基線間包圍的面積。第十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日㈣分離度（分辨率）R柱效能和選擇性對(duì)分離的影響柱效選擇性差差

差好

好好第二十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日

因此，單獨(dú)用柱效或選擇性不能真實(shí)反映組分在色譜柱中的分離情況，需引入一個(gè)綜合指標(biāo)—分離度R

分離度：相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰底寬度平均值之比。即第二十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日

理論證明，若相鄰兩色譜峰對(duì)稱且滿足正態(tài)分布，當(dāng)R<1兩峰部分重疊

R=1.0分離程度可達(dá)98%

R=1.5分離程度可達(dá)99.7%

通常，R=1.5作為相鄰兩峰完全分離的標(biāo)志。第二十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日色譜從流出曲線中，可得到重要信息：⑴根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少數(shù)目；⑵根據(jù)色譜峰的保留值，可以定性分析；⑶根據(jù)色譜峰的面積和峰高，可以定量分析⑷色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)；⑸色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相（或流動(dòng)相）選擇是否合適的依據(jù)。第二十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日三、分配系數(shù)與色譜分離㈠分配系數(shù)和容量因子1.分配系數(shù)K

式中cs、cm分別為組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度。

K與溫度、壓力有關(guān)；也與組分性質(zhì)、流動(dòng)相、固定相性質(zhì)有關(guān)。條件一定時(shí)，K一定。第二十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日2.容量因子k（分配比、保留因子）式中mS、mm分別為組分在固定相和流動(dòng)相中物質(zhì)的質(zhì)量。容量因子不僅與溫度和壓力有關(guān)，而且還與固定相和流動(dòng)相的體積比有關(guān)。第二十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日3.分配系數(shù)和容量因子的關(guān)系第二十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日㈡分配系數(shù)和容量因子與保留時(shí)間的關(guān)系意義：在色譜圖上找出tR、t0，則可計(jì)算出k，即可以直接從色譜圖上求得分配比（容量因子）k。反之，分配系數(shù)不同的組分具有不同的保留值，因而在色譜圖上有不同位置的色譜峰。第二十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日見(jiàn)P343第二十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日㈢色譜分離的前提

由上式可見(jiàn)，若使ΔtR≠0,必須KA≠KB,即分配系數(shù)不等是分離的前提。第二十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)基本類型色譜方法及其分離機(jī)制一、分配色譜（見(jiàn)P345頁(yè)）1.正相分配色譜：流動(dòng)相極性＜固定相極性2.反相分配色譜：流動(dòng)相極性＞固定相極性洗脫順序由組分在固定相或流動(dòng)相中溶解度的相對(duì)大小而決定。二、吸附色譜法第三十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)色譜法基本原理一、塔板理論（半經(jīng)驗(yàn)理論）（P351）

該理論是1952年馬丁（Martin）等人提出

從熱力學(xué)角度討論了流出曲線形狀與分離效果關(guān)系。第三十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日

塔板理論將色譜柱假想為一個(gè)精餾塔。即色譜柱（柱長(zhǎng)L）是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成，每一塊塔板高度為H，在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方向向前移動(dòng)。第三十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日塔板理論的基本假設(shè)為：1）色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。2）樣品加在第0號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。3）流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積4）在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無(wú)關(guān)。

第三十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日

雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過(guò)程不符，如色譜過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，很難達(dá)到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評(píng)價(jià)色譜柱柱效。第三十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日n與色譜參數(shù)之間的關(guān)系（經(jīng)驗(yàn)公式）為：

由此可以看出，組分保留時(shí)間越長(zhǎng)、峰寬度越小，則n越多，色譜柱效能越高。第三十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日塔板理論貢獻(xiàn)：①分配系數(shù)不同，最終可分離。②平衡次數(shù)n

（>50），曲線接近正態(tài)分布曲線。③給出了n與Wb的關(guān)系式（由此關(guān)系式可得出流出曲線與分離效果關(guān)系）n

，柱效。若兩組分K相同，則無(wú)論n多大，都無(wú)法分離。第三十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日塔板理論不足：①無(wú)法解釋峰擴(kuò)展原因。（為使n↑，則Wb應(yīng)↓，如何使Wb↓

？）②無(wú)法解釋影響塔板高度的因素（L一定，n∝1/H,如何使H↓？）

第三十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日二、速率理論

1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來(lái)，提出了色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)理論--速率理論。它把色譜過(guò)程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過(guò)程，研究過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響。第三十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日速率理論的簡(jiǎn)化方程式:

H=A+B/u+Cu㈠影響塔板高度(柱效)的動(dòng)力學(xué)因素⒈渦流擴(kuò)散：A=2λdp由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。dp為填料直徑，λ為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻λ越大。

HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會(huì)使柱壓過(guò)高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小?？偟恼f(shuō)來(lái)，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無(wú)填料，A＝0。

第三十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日⒉縱向擴(kuò)散：

B=2γDm由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。

u為流動(dòng)相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長(zhǎng)（u?。?，展寬越嚴(yán)重。在低流速時(shí)，它對(duì)峰形的影響較大。Dm為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。

γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分