2023年7第3章基因工程第9、10節(jié)

第7第3章基因工程第9、10節(jié)

生物技術(shù)制藥36講

第九節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制是利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)是利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，物的分子量較大，物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)還參與生理功能的調(diào)節(jié)，構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成嚴(yán)重危害。貽誤病情造成嚴(yán)重危害。

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宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過程中都可能發(fā)生變化，中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過程都必須嚴(yán)格控制條件和鑒定質(zhì)量。制條件和鑒定質(zhì)量。

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一、原材料的質(zhì)量控制原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性序列的正確性，藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而生物來自單一克隆，穩(wěn)定，穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。一致性。

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根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性：特性：明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，⒈明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；和核苷酸序列予以確證；

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⒉應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、傳特性及各組成部分(如復(fù)制子、傳特性及各組成部分(如復(fù)制子、啟動子)的來源與功能，啟動子)的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物；記物；應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、⒊應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；

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⒋須闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；遺傳穩(wěn)定性；⒌提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，在生產(chǎn)過程中啟動與控制基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。

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二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制在工程菌的貯存中，在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。始終能排除外源微生物污染。

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生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無細(xì)菌、病毒、癌因子，無細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫。建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫。

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原始種子批須確證克隆基因DNA序列

詳細(xì)敘述種子批來源、序列，DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計使用期，方式、保存及預(yù)計使用期，保存與復(fù)蘇時宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。定性。

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對生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)對生產(chǎn)種子，胞生長與產(chǎn)品生成的方法和材料，胞生長與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；最高允許傳種代數(shù)；

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在培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表在培養(yǎng)過程中，達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；依宿主細(xì)胞依宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。并定期評價細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。

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培養(yǎng)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測培養(yǎng)周期結(jié)束時，宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。載體的酶切圖譜等。

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三、純化工藝過程的質(zhì)量控制產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，子批間保持一致性；子批間保持一致性；外源蛋白DNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。限度以下。

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在精制過程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測方法。方法。

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四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項要求:產(chǎn)品的鑒別、包括以下幾項要求:產(chǎn)品的鑒別、純活性、安全性、度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、性。它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。鑒定方法。

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⒈產(chǎn)品的鑒別常用的鑒定方法:常用的鑒定方法:電泳方法:SDS、等電聚焦、電泳方法:SDS、等電聚焦、免疫電泳免疫學(xué)方法:放射免疫(RIA)、免疫學(xué)方法:放射免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫(ELISA)免疫(ELISA)受體結(jié)合試驗高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、圓二色譜、末端序列分析、圓二色譜、核磁共振

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⑴肽圖分析肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì),目的蛋白質(zhì),對生成的肽段進(jìn)行分離分析。它是檢測蛋白

質(zhì)一級結(jié)構(gòu)最有效的方法，的方法，該技術(shù)靈敏高效是對基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評價和驗證的首選方法。常用HPLC、評價和驗證的首選方法。常用HPLC、毛細(xì)管電泳。毛細(xì)管電泳。

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⑵氨基酸成分分析50個氨基酸較理想50個氨基酸較理想⑶部分氨基酸序列分析N端15個氨基酸可作為重15個氨基酸可作為重組蛋白質(zhì)和多