分光光度法優(yōu)秀課件

第八章吸光光度法1化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er0.1%～0.2%

依據(jù)化學(xué)反應(yīng),使用玻璃儀器

化學(xué)分析與儀器分析方法比較儀器分析：微量組分(<1%),Er1%～5%

依據(jù)物理或物理化學(xué)性質(zhì),需要特殊的儀器例:含F(xiàn)e約0.05%的樣品,稱0.2g,則m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,稱不準(zhǔn)容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,測(cè)不準(zhǔn)光度法結(jié)果0.048%～0.052%,滿足要求準(zhǔn)確度高靈敏度高26.1概述（1）定義：吸光光度法是基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法，包括比色法、可見(jiàn)及紫外吸光光度法及紅外光譜法等。我們重點(diǎn)討論可見(jiàn)光區(qū)的吸光光度法。3微粒性

h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J·s

－頻率

E－光量子具有的能量單位：J(焦耳)，eV(電子伏特)

光量子，具有能量。5波粒二象性結(jié)論:一定波長(zhǎng)的光具有一定的能量，波長(zhǎng)越長(zhǎng)(頻率越低)，光量子的能量越低。真空中:6光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外近紫外可見(jiàn)近紅外中紅外遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~380nm380nm

~780nm780nm~2.5m2.5m

~50m50m

~300m73.溶液中溶質(zhì)分子對(duì)光的吸收與吸收光譜/nm顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠不同顏色的可見(jiàn)光波長(zhǎng)及其互補(bǔ)光物質(zhì)的顏色是因物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收作用而產(chǎn)生的。9*吸收光譜曲線或光吸收曲線（absorptioncurve）：以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖。*最大吸收波長(zhǎng)（maximumabsorptionwavelengh）：光吸收程度最大處的波長(zhǎng)，用λmax表示*吸光度（absorbance）

在可見(jiàn)光，KMnO4溶液對(duì)波長(zhǎng)525nm附近綠色光的吸收最強(qiáng)，而對(duì)紫色和紅色的吸收很弱。λmax=525nm。濃度不同時(shí)，光吸收曲線形狀相同，λmax不變，吸光度不同。10苯和甲苯在環(huán)己烷中的吸收光譜苯(254nm)甲苯(262nm)A23025027011

（4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長(zhǎng)下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。（5）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測(cè)定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù)。133.目視比色法和吸光光度法的特點(diǎn)

特點(diǎn)靈敏度高：測(cè)定下限可達(dá)10-5～10-6mol/L,10-4%～10-5%準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測(cè)定要求：相對(duì)誤差2～5％（1～2％）操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用廣泛c141.朗伯-比爾定律（Lambert-Beerlaw）

當(dāng)一束平行單色光通過(guò)任何均勻、非散射的固體、液體或氣體介質(zhì)時(shí)，一部分被吸收，一部分透過(guò)介質(zhì)，一部分被器皿的表面反射。如圖6-3所示，設(shè)人射光強(qiáng)度為I'0，吸收光強(qiáng)度為Ia，透過(guò)光強(qiáng)度為It，反射光強(qiáng)度為Ir。6.1.2光吸收的基本定律15透射比或透光度（Transmittance）

透過(guò)光強(qiáng)度It與人射光強(qiáng)度Io之比稱為透射比或透光度，用T表示。溶液的透射比愈大，表示它對(duì)光的吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它對(duì)光的吸收愈大。17

朗伯(LambertJH)和比爾(BeerA)分別于1760和1852年研究了光的吸收與溶液層的厚度及溶液濃度的定量關(guān)系，二者結(jié)合稱為朗伯-比爾定律，也稱為光的吸收定律。

當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的平行單色光垂直照射到長(zhǎng)度為b的液層、濃度為c的溶液時(shí)，由于溶液中吸光質(zhì)點(diǎn)(分子或離子)的吸收，通過(guò)溶液后光的強(qiáng)度減弱為It：A=lg(I0/It)=kbc吸光度介質(zhì)厚度(cm)18吸光度與光程的關(guān)系A(chǔ)=bc

光源檢測(cè)器0.00吸光度檢測(cè)器b樣品光源0.22吸光度光源檢測(cè)器0.44吸光度b樣品b樣品19K吸光系數(shù)Absorptivity

a的單位:L·g-1·cm-1當(dāng)c的單位用g·L-1表示時(shí)，用a表示，

A＝abc的單位:L·mol-1·cm-1當(dāng)c的單位用mol·L-1表示時(shí)，用表示.

－摩爾吸光系數(shù)MolarAbsorptivity

A＝bc

越大,靈敏度越高:

104～5×104為中等靈敏度;>105為高靈敏度;<104為低靈敏度.212.摩爾吸光系數(shù)ε的討論（1）吸收物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和溶劑條件下的特征常數(shù)（2）不隨濃度c和光程長(zhǎng)度b的改變而改變。在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí)，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測(cè)物濃度無(wú)關(guān)；（3）可作為定性鑒定的參數(shù)；（4）同一吸收物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的ε值是不同的。在最大吸收波長(zhǎng)λmax處的摩爾吸光系數(shù)，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測(cè)定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。

22桑德?tīng)栰`敏度（S）：

定義：當(dāng)儀器的檢測(cè)極限為A=0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所檢出的吸光物質(zhì)的最低含量。定義式：S=Cminb（C:g/cm3;b:cm）推導(dǎo)式：S=M/（g/cm2）232.吸光光度法和分光光度計(jì)光源單色器吸收池檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)壓電源分光光度法的基本部件通過(guò)棱鏡或光柵得到一束近似的單色光.波長(zhǎng)可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高.25722型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)方框圖《基礎(chǔ)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)》p93光源吸收池檢測(cè)系統(tǒng)分光系統(tǒng)26棱鏡：依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過(guò)棱鏡時(shí)折射率不同單色器入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ280060050040029光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵光柵衍射示意圖原理：利用光通過(guò)光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.30檢測(cè)器SeAu，Ag半導(dǎo)體h硒光電池Ag、Au31光電管紅敏管625-1000nm藍(lán)敏管200-625nmNi環(huán)（片）堿金屬光敏陰極h32光電倍增管待掃描160-700nm1個(gè)光電子可產(chǎn)生106～107個(gè)電子331.顯色反應(yīng)的選擇*靈敏度高，一般ε>104*選擇性好*顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收。

對(duì)照性好,λmax>60nm.*反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定。*顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。6.2光度分析法的設(shè)計(jì)6.2.1顯色反應(yīng)34：：：：助色團(tuán)－NH2，－OH，－X（孤對(duì)電子）ne2.顯色劑O生色團(tuán)：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共軛雙鍵）πe無(wú)機(jī)顯色劑:SCN-

[Fe(SCN)]2+H2O2

[TiO·H2O2]2+有機(jī)顯色劑:35有機(jī)顯色劑

CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：雙硫腙NN型：丁二酮肟鄰二氮菲磺基水楊酸36

實(shí)驗(yàn)條件包括:溶液酸度，顯色劑用量，試劑加入順序，顯色時(shí)間，顯色溫度，有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。（1）溶液的酸度M+HR===MR+H+*影響顯色劑的平衡濃度和顏色*影響被測(cè)金屬離子的存在狀態(tài)*影響絡(luò)合物的組成

pH與吸光度關(guān)系曲線確定pH范圍。6.2.2顯色條件的選擇37（2）顯色劑的用量M(被測(cè)組分)+R(顯色劑)==MR(有色絡(luò)合物)為使顯色反應(yīng)進(jìn)行完全，需加入過(guò)量的顯色劑。但顯色劑不是越多越好。有些顯色反應(yīng)，顯色劑加人太多，反而會(huì)引起副反應(yīng)，對(duì)測(cè)定不利。在實(shí)際工作中根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定顯色劑的用量。

c(R)c(R)c(R)38（3）顯色反應(yīng)時(shí)間

有些顯色反應(yīng)瞬間完成，溶液顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持不變;有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成，但有色絡(luò)合物的顏色很快開(kāi)始褪色;有些顯色反應(yīng)進(jìn)行緩慢，溶液顏色需經(jīng)一段時(shí)間后才穩(wěn)定。制作吸光度-時(shí)間曲線確定適宜時(shí)間。（4）顯色反應(yīng)溫度：顯色反應(yīng)大多在室溫下進(jìn)行。但是，有些顯色反應(yīng)必需加熱至一定溫度完成。（5）溶劑：有機(jī)溶劑降低有色化合物的解離度，提高顯色反應(yīng)的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮顏色加深。還可能提高顯色反應(yīng)的速率，影響有色絡(luò)合物的溶解度和組成等。39鄰二氮菲－亞鐵反應(yīng)完全度與pH的關(guān)系Fe2++3RH＋H＋A檸檬酸c(R)≈[R′]=10-4mol·L-1β3＝1021.3β3FeR340pH3～8為適宜的酸度范圍41（6）干擾及其消除方法a.控制溶液酸度b.加入掩蔽劑選取的條件是掩蔽劑不與待測(cè)離子作用，掩蔽劑以及它與干擾物質(zhì)形成的絡(luò)合物的顏色應(yīng)不干擾待測(cè)離子的測(cè)定。c.利用氧化還原反應(yīng)，改變干擾離子的價(jià)態(tài)d.利用校正系數(shù)e.用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾。f.選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)g.當(dāng)溶液中存在有消耗顯色劑的干擾離子時(shí)，可通過(guò)增加顯色劑的用量來(lái)消除干擾。h.分離以上方法均不奏效時(shí)，采用預(yù)先分離的方法。426.2.3測(cè)量波長(zhǎng)和吸光度范圍的選擇（1）測(cè)量波長(zhǎng)的選擇為了使測(cè)定結(jié)果有較高的靈敏度，應(yīng)選擇被測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)的光作為入射光，這稱為“最大吸收原則”（maximumabsorption）。選用這種波長(zhǎng)的光進(jìn)行分析，不僅靈敏度高，且能減少或消除由非單色光引起的對(duì)朗伯-比爾定律的偏離。但是，在最大吸收波長(zhǎng)處有其他吸光物質(zhì)干擾測(cè)定時(shí)，則應(yīng)根據(jù)入射光波長(zhǎng)吸收最大，干擾最小的原則。43例丁二酮肟光度法測(cè)鋼中鎳，絡(luò)合物丁二酮肟鎳的最大吸收波長(zhǎng)為470nm，但試樣中的鐵用酒石酸鈉掩蔽后，在470nm處也有一定吸收，干擾鎳的測(cè)定。為避免鐵的干擾，可以選擇波長(zhǎng)520nm進(jìn)行測(cè)定，雖然測(cè)鎳的靈敏度有所降低，但酒石酸鐵不干擾鎳的測(cè)定。44（2）吸光度范圍的選擇

從儀器測(cè)量誤差的角度來(lái)看，為使測(cè)量結(jié)果得到較高的準(zhǔn)確度，一般應(yīng)控制標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測(cè)試液的吸光度在0.2~0.8范圍內(nèi)。可通過(guò)控制溶液的濃度或選擇不同厚度的吸收池來(lái)達(dá)到目的。456.2.4參比溶液的選擇利用參比溶液來(lái)調(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn)，可消除由吸收池壁及溶劑對(duì)入射光的反射和吸收帶來(lái)的誤差，扣除干擾的影響。參比溶液選擇：a試液及顯色劑均無(wú)色，蒸餾水作參比溶液。b顯色劑為無(wú)色，被測(cè)試液中存在其他有色離子，用不加顯色劑的被測(cè)試液作參比溶液。c顯色劑有顏色，可選擇不加試樣溶液的試劑空白作參比溶液。46d顯色劑和試液均有顏色，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，將被測(cè)組分掩蔽起來(lái)，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其他試劑均按試液測(cè)定方法加入，以此作為參比溶液，這樣就可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。e改變加入試劑的順序，使被測(cè)組分不發(fā)生顯色反應(yīng)，可以此溶液作為參比溶液消除干擾。4701234mg/mlA。。。。*0.80.60.40.20溶液濃度的測(cè)定A＝bc工作曲線法(校準(zhǔn)曲線)6.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(p229)486.3光度分析法的誤差1對(duì)朗伯-比爾定律的偏離

在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈直線的情況，特別是當(dāng)吸光物質(zhì)濃度較高時(shí)，明顯地看到通過(guò)原點(diǎn)向濃度軸彎曲的現(xiàn)象(吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進(jìn)行定量，將會(huì)引起較大的誤差。偏離朗伯－比爾定律的原因主要是儀器或溶液的實(shí)際條件與朗伯-比爾定律所要求的理想條件不一致。49（1）非單色光引起的偏離*朗伯-比爾定律只適用于單色光，但由于單色器色散能力的限制和出口狹縫需要保持一定的寬度，所以目前各種分光光度計(jì)得到的入射光實(shí)際上都是具有某一波段的復(fù)合光。由于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度的不同，因而導(dǎo)致對(duì)朗伯－比爾定律的偏離。

50*克服非單色光引起的偏離的措施◎使用比較好的單色器，從而獲得純度較高的“單色光”，使標(biāo)準(zhǔn)曲線有較寬的線性范圍。◎人射光波長(zhǎng)選擇在被測(cè)物質(zhì)的最大吸收處，保證測(cè)定有較高的靈敏度，此處的吸收曲線較為平坦，在此最大吸收波長(zhǎng)附近各波長(zhǎng)的光的ε值大體相等，由于非單色光引起的偏離要比在其他波長(zhǎng)處小得多?！驕y(cè)定時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶刮舛茸x數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。51（2）介質(zhì)不均勻引起的偏離朗伯－比爾定律要求吸光物質(zhì)的溶液是均勻的。如果被測(cè)溶液不均勻，是膠體溶液、乳濁液或懸浮液時(shí)，入射光通過(guò)溶液后，除一部分被試液吸收外，還有一部分因散射現(xiàn)象而損失，使透射比減少，因而實(shí)測(cè)吸光度增加，便標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線向吸光度軸彎曲。故在光度法中應(yīng)避免溶液產(chǎn)生膠體或混濁。52（3）由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離溶液中的吸光物質(zhì)常因解離、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等化學(xué)變化而改變其濃度，因而導(dǎo)致偏離朗伯—比爾定律。A解離大部分有機(jī)酸堿的酸式、堿式對(duì)光有不同的吸收性質(zhì)，溶液的酸度不同，酸(堿)解離程度不同，導(dǎo)致酸式與堿式的比例改變，使溶液的吸光度發(fā)生改變。53

B絡(luò)合顯色劑與金屬離子生成的是多級(jí)絡(luò)合物，且各級(jí)絡(luò)合物對(duì)光的吸收性質(zhì)不同，例如在Fe(Ⅲ)與SCN-的絡(luò)合物中，F(xiàn)e(SCN)3顏色最深，F(xiàn)e(SCN)2+顏色最淺，故SCN-濃度越大，溶液顏色越深，即吸光度越大。c締合例如在酸性條件下，CrO42-會(huì)締合生成Cr2O72-，而它們對(duì)光的吸收有很大的不同。在分析測(cè)定中，要控制溶液的條件，使被測(cè)組分以一種形式存在，以克服化學(xué)因素所引起的對(duì)朗伯－比爾定律的偏離。542吸光度測(cè)量的誤差在吸光光度分析中，儀器測(cè)量不準(zhǔn)確也是誤差的主要來(lái)源。任何光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差。這些誤差可能來(lái)源于光源不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)條件偶然變動(dòng)，讀數(shù)不準(zhǔn)確等。

在光度計(jì)中，透射比的標(biāo)尺刻度均勻。吸光度標(biāo)尺刻度不均勻。對(duì)于同一儀器，讀數(shù)的波動(dòng)對(duì)透射比為一定值；而對(duì)吸光度讀數(shù)波動(dòng)則不再為定值。吸光度越大，讀數(shù)波動(dòng)所引起的吸光度誤差也越大55

透射比很小或很大時(shí)，濃度測(cè)量誤差都較大，即光度測(cè)量最好選吸光度讀數(shù)在刻度尺的中間而不落兩端。待測(cè)溶液的透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，才能保證測(cè)量的相對(duì)誤差較小。當(dāng)A=0.434(或透射比T=36.8%)時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小。

566.4其他吸光光度法及吸光光度法應(yīng)用1示差吸光光度法2雙波長(zhǎng)吸光光度法3弱酸和弱堿解離常數(shù)的測(cè)定4絡(luò)合物組成的測(cè)定57（1）示差吸光光度法的原理

吸光光度法一般僅適用于微量組分的測(cè)定，當(dāng)待測(cè)定組分濃度過(guò)高或過(guò)低，會(huì)引起很大的測(cè)量誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低。示差吸光光度法可克服這一缺點(diǎn)。目前，主要有高濃度示差吸光光度法、低濃度示差吸光光度法和使用兩個(gè)參比溶液的精密示差吸光光度法。它們的基本原理相同，且以高濃度示差吸光光度法應(yīng)用最多，僅介紹高濃度示差吸光光度法。6.4.1示差吸光光度法58

吸光度差與這兩種溶液的濃度差成正比。以把空白溶液作為參比的稀溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為ΔA和Δc的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)得的ΔA求出相應(yīng)的Δc值，從cx=co+c可求出待測(cè)試液的濃度，這就是示差吸光光度法定量的基本原理。59（2）示差吸光光度法的誤差Δc(即cx－co)，測(cè)量誤差為x%，結(jié)果為cx±(cx-co)×x%；普通光度法的結(jié)果為cx±cx·x%。因cx只是稍大于co，故cx總是遠(yuǎn)大于Δc，故示差吸光光度法的準(zhǔn)確度高。參比溶液的濃度越接近待測(cè)試液的濃度，測(cè)量誤差越小，最小誤差可達(dá)0.3%。60（1）雙波長(zhǎng)吸光光度法的原理

使兩束不同波長(zhǎng)的單色光以一定的時(shí)間間隔交替地照射同一吸收池，測(cè)量并記錄兩者吸光度的差值。這樣就可以從分析波長(zhǎng)的信號(hào)中扣除來(lái)自參比波長(zhǎng)的信號(hào)，消除各種干擾，得待測(cè)組分的含量。分析方法的靈敏度、選擇性及測(cè)量的精密度高。被廣泛用于環(huán)境試樣及生物試樣的分析。6.4.2雙波長(zhǎng)吸光光度法61

ΔA與吸光物質(zhì)濃度成正比。這是定量的理論依據(jù)。只用一個(gè)吸收池，以試液本身對(duì)某一波長(zhǎng)的光的吸光度為參比，消除了因試液與參比液及兩個(gè)吸收池之間的差異引起的測(cè)量誤差，提高測(cè)量的準(zhǔn)確度。62（2）雙波長(zhǎng)吸光光度法的應(yīng)用*混濁試液中組分測(cè)定：一般選擇待測(cè)組分的最大吸收波長(zhǎng)為測(cè)量波長(zhǎng)(λl)，選擇與其相近而兩波長(zhǎng)相差在40~60nm范圍內(nèi)且有較大的ΔA值的波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)。*單組分的測(cè)定：進(jìn)行單組分的測(cè)定，以絡(luò)合物吸收峰作測(cè)量波長(zhǎng)，參比波長(zhǎng)的選擇有：以等吸收點(diǎn)為參比波長(zhǎng);以有色絡(luò)合物吸收曲線下端的某一波長(zhǎng)作為參比波長(zhǎng)；以顯色劑的吸收峰為參比波長(zhǎng)。63*兩組分共存時(shí)的分別測(cè)定：當(dāng)兩種組分的吸收光譜有重疊時(shí)，要測(cè)定其中一個(gè)組分就必須消除另一組分