Lowrys法Folin-酚試劑法-測定血清中蛋白質(zhì)的含量課件

怎樣測定血清中蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)含量測定的常用方法比較方法靈敏度優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)凱氏定氮法0.2～1.0mg干擾少，準(zhǔn)確操作復(fù)雜，費(fèi)時紫外吸收法50～100mg快速簡便無損樣品靈敏度低干擾物較多考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）1～5ug靈敏、簡便、快速不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差雙縮脲法1～20mg干擾相對少，較快靈敏度低Lowry法20～250ug靈敏度高干擾物質(zhì)多、費(fèi)時、操作嚴(yán)格計時選擇測定方法時應(yīng)考慮：1、實(shí)驗樣品對測定所要求的靈敏度和精確度；2、蛋白質(zhì)的性質(zhì)；3、溶液中存在的干擾物質(zhì)；4、測定所花費(fèi)的時間等。實(shí)驗?zāi)康?、掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理及其實(shí)驗操作技術(shù)。2、掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要領(lǐng)和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品溶液中待測物質(zhì)含量的方法。原理

1921年，F(xiàn)olin

首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。

1951年，Lowry對此法進(jìn)行了改進(jìn)，先在標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。原理第一步：雙縮脲反應(yīng)

在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個肽鍵,因此有雙縮脲反應(yīng)。即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。即根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。原理樣品健康人血清正常人血清蛋白質(zhì)含量：60~80g/L試劑1、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200μg/ml）2、堿性硫酸銅溶液（當(dāng)日有效）3、Folin-酚試劑操作各管混勻，室溫放置10min。向各管內(nèi)加入Folin-酚試劑0.20mL,2s內(nèi)迅速混勻！40℃放置10min。冷卻至室溫后，以500nm波長比色，用1號管作空白，讀取各管吸光度。試劑（ml)123456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液-0.200.400.600.80-樣品液（稀釋300倍）-----0.50蒸餾水1.00.800.600.400.200.50堿性硫酸銅2.02.02.02.02.02.0蛋白質(zhì)濃度（μg/ml）04080120160？？注意事項Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。

注意事項因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。即第1支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20mLFolin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20mLFolin-酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。水浴10min，流水冷卻后，每1分鐘拿出一管，測吸光值。蛋白樣品堿性銅試劑混勻，放10min加酚試劑2s混勻水浴10min放至室溫比色繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟1、選擇合適的坐標(biāo)紙2、畫坐標(biāo)軸3、根據(jù)測得的數(shù)據(jù)描點(diǎn)4、連線5、求實(shí)驗結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，用鉛筆繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度A蛋白質(zhì)濃度C（μg/ml）0.20.40.6....4080120160繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線要求：根據(jù)所描點(diǎn)的分布情況，作直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗點(diǎn)的平均變動情況，因此該線不需全部通過各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過線上的實(shí)驗點(diǎn)均勻分布在曲線或直線兩側(cè)。本方法的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍；2.操作簡單，不需特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：1.操作時間較長，要精確控制操作時間；2.標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格的直線形式；3.專一性較差，干擾物質(zhì)較多。

復(fù)習(xí)思考題1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？

請將答案附在實(shí)驗報告上！V-1100分光光度計操作步驟開機(jī)，預(yù)熱30分鐘；轉(zhuǎn)動波長旋鈕，調(diào)所需波長。按鍵切換到T檔；將黑體放入光路中，合上蓋，按鍵校零；開蓋，將參比液按空白液、標(biāo)準(zhǔn)液、待測液的順序放入比色杯架上，合上蓋，按鍵切換到A檔；拉動比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋，按鍵校零；拉動拉桿，將標(biāo)準(zhǔn)