實(shí)驗(yàn)酶切連接及電泳檢測(cè)詳解演示文稿

實(shí)驗(yàn)酶切連接及電泳檢測(cè)詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（優(yōu)選）實(shí)驗(yàn)酶切連接及電泳檢測(cè)現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六

質(zhì)粒在正常情況下以共價(jià)閉合環(huán)狀cccDNA構(gòu)型(超螺旋scDNA)存在，在提取過程中由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能會(huì)使DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)狀/超螺旋DNA(cccDNA)；開環(huán)DNA(ocDNA）；線形DNA(LDNA)質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳模式圖關(guān)于電泳條帶現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六質(zhì)粒DNA的帶型分析MpUC19環(huán)形質(zhì)粒DNA超螺旋粒DNA現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六出現(xiàn)問題電泳條帶濃度和純度電泳條帶拖尾現(xiàn)象（加樣過多，離子濃度，膠未完全凝固）質(zhì)粒DNA的帶型分析現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六實(shí)驗(yàn)六

DNA的酶切、連接及電泳檢測(cè)現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六實(shí)驗(yàn)步驟（一）質(zhì)粒DNA酶切(注：每人一管）在200μl的薄壁離心管中，按照下表加入試劑（單位：μl）↓混勻；點(diǎn)動(dòng)離心將反應(yīng)液甩至管底。37℃(PCR儀)保溫1-2h進(jìn)行酶切反應(yīng)。↓反應(yīng)結(jié)束后，75℃，保溫10min使酶失活?！娪緳z測(cè)

樣品代號(hào)成份反應(yīng)1（標(biāo)準(zhǔn)pUC19)ddH2O無(wú)菌水(μl)7pUC19質(zhì)粒(μl)1010*H酶切緩沖液(μl)2EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)20現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六酶切樣品代號(hào)成份反應(yīng)（標(biāo)準(zhǔn)pUC19)ddH2O無(wú)菌水(μl)7pUC19質(zhì)粒(μl)1010*H酶切緩沖液(μl)2EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)20現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（二）DNA片段的連接(注：每人一管）取200μl的離心管按下表加入試劑?！靹蚝簏c(diǎn)動(dòng)離心，將溶液甩至管底↓置于已調(diào)好溫度為12℃-16℃PCR儀中↓保溫1-2h后取出↓電泳檢測(cè)樣品代號(hào)成分用量（μl）ddH2OddH2O7.0T14λDNA/EcoT14I片段10.010*T4連接緩沖液2.0T4T4DNA連接酶1.0總體積20現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六連接樣品代號(hào)成分用量（μl）HddH2O7.0T14λDNA/EcoT14I片段10.0Buffer連接緩沖液2.0T4T4DNA連接酶1.0總體積20現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（三）質(zhì)粒酶切樣品和DNA連接樣品的電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠的制備：制備2塊0.7%（0.28g/40ml）和2塊1.2%瓊脂糖凝膠（0.48g/40ml）。（注：全班制備4塊膠）現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六1、掌握限制性內(nèi)切酶的特性及酶切體系的建立；2、了解影響酶切的因素；3、掌握DNA連接酶的性質(zhì)以及連接體系的建立；4、了解影響連接反應(yīng)的因素。實(shí)驗(yàn)?zāi)康默F(xiàn)在是12頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建DNA重組子

利用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA+利用DNA連接酶連接DNA是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟之一。成功的酶切和有效的連接為后續(xù)的外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)提供了有效的實(shí)驗(yàn)材料?，F(xiàn)在是13頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1965年WernerArber第一個(gè)描述了限制性內(nèi)切現(xiàn)象；HamiltonO.Smith第一個(gè)純化了限制性內(nèi)切酶，并鑒定了其性質(zhì)；DanielNathans用這些酶將SV40病毒的DNA切割成了特定的片段，并繪制了SV40病毒基因組的“物理圖譜”。1978年這三人獲得了當(dāng)年的Nobel獎(jiǎng)。ArberW.SmithH.O.NathansD.現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六第一個(gè)DNA重組分子1972年P(guān)aulBerg等人利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和連接酶獲得了第一個(gè)DNA重組分子。標(biāo)志著遺傳工程的開始。TheNobelPrizeinChemistry1980

PaulBerg現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建DNA重組子酶切連接現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六實(shí)驗(yàn)原理–酶切

限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶能特異性地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。

現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的DNA卻無(wú)損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否有修飾酶活性，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三類。DNA重組技術(shù)中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型切割位點(diǎn)則在下游24-26bp處。Ⅰ類需Mg2+、SAM及ATP識(shí)別位點(diǎn)復(fù)雜，特異性差，切割位點(diǎn)距識(shí)別點(diǎn)遠(yuǎn)。Ⅱ類僅需Mg2+識(shí)別切割特異性強(qiáng)，切割發(fā)生在識(shí)別位點(diǎn)。Ⅲ類需Mg2+及ATP切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)周圍，酶活性不單一。現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六命名一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株(品系)。例如，從BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性內(nèi)切酶稱為BamH，在同一品系細(xì)菌中得到的識(shí)別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號(hào)，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六II型限制性內(nèi)切酶主要特點(diǎn)：識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。在分子克隆實(shí)驗(yàn)中使用最普遍的是那些識(shí)別4個(gè)或6個(gè)堿基對(duì)的限制性內(nèi)切酶。II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝兩個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：粘性末端和平頭末端。如:EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?/p>

5’……GAATTC……3’

3’…….CTTAAG……5’回文結(jié)構(gòu)的對(duì)稱軸現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六

限制性內(nèi)切酶的活性以酶的活性單位表示，1個(gè)酶單位（1Unit）指的是在指定緩沖液中，37℃下反應(yīng)60min,完全酶切1μg的純DNA所用的酶量。

影響酶切的因素：在酶切反應(yīng)中，DNA的純度、緩沖液中的離子強(qiáng)度、Mg2+等因素均可影響反應(yīng)，一般可通過增加酶的用量，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施以達(dá)到完全酶切。但應(yīng)該注意的是，過多的酶量和過長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間會(huì)造成非特異性的酶切(星號(hào)活性)。圖:構(gòu)建DNA重組子現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六材料、試劑及器具1、材料與試劑酶切反應(yīng)：標(biāo)準(zhǔn)pUC19(2686bp)EcoRⅠ及其配套的酶切緩沖液檢測(cè)：0.5×TBE電泳緩沖液6×電泳載樣緩沖液、Goldview、瓊脂糖現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六2、器具：水平式電泳裝置電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī)恒溫水浴鍋（用PCR儀代理）微量移液槍微波爐或電爐紫外透射儀照相機(jī)及其附件現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六實(shí)驗(yàn)步驟（一）質(zhì)粒DNA酶切(注：每人一管）在200μl的薄壁離心管中，按照下表加入試劑（單位：μl）↓混勻；點(diǎn)動(dòng)離心將反應(yīng)液甩至管底。37℃(PCR儀)保溫1-2h進(jìn)行酶切反應(yīng)?！磻?yīng)結(jié)束后，75℃，保溫10min使酶失活?！娪緳z測(cè)

樣品代號(hào)成份反應(yīng)1（標(biāo)準(zhǔn)pUC19)無(wú)菌水(μl)2P質(zhì)粒(μl)6H酶切緩沖液(μl)1EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)10現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（三）質(zhì)粒酶切樣品、DNA連接樣品的電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠的制備：制備2塊0.7%（0.28g/40ml)現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（四）加樣及電泳檢測(cè)1、酶切樣品的檢測(cè)酶切陰性對(duì)照（M1）：pUC19標(biāo)樣20μl+6X的loadingbuffer4μl酶切樣品：pUC19酶切樣品20μl+6X的loadingbuffer3μl(1)現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六

DNA連接酶是1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補(bǔ)鏈配對(duì)結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶有兩種：來自大腸桿菌的DNA連接酶和來自噬菌體的T4DNA連接酶。二者的作用機(jī)理類似。實(shí)驗(yàn)原理–

連接現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六核酸片段可以通過連接酶的作用連接起來而獲得重組分子。DNA連接酶催化雙鏈DNA分子中相鄰堿基的5’-PO4末端與3’-OH間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。一個(gè)DNA片段的5’-PO4末端與另一個(gè)3’-OH末端相互靠近時(shí)，在DNA連接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的緩沖系統(tǒng)中可以被連接起來而形成重組分子。DNA連接酶作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)原理–連接酶焦磷酸根酶-焦磷酸根酶現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六T4DNA連接酶作用機(jī)制：T4DNA連接酶作用分三步：(1)T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶－AMP復(fù)合物。(2)酶－AMP復(fù)合物結(jié)合到具有5’－磷酸基和3’－羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。(3)產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六常用的DNA連接酶是T4DNA連接酶，其作用底物是雙鏈的DNA分子或RNA：DNA雜交分子，可以連接粘性末端、平末端。T4DNA連接酶的活性用Weiss單位表示。1Weiss單位是指在37℃下20min內(nèi)催化1nmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需的酶量?，F(xiàn)在是31頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六T4DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為３７℃，為什么實(shí)驗(yàn)中采用１２～14℃？1.粘性末端形成的氫鍵在低溫下更穩(wěn)定；2.連接反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，低溫下酶不容易失活現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六材料、試劑及器具1、材料與試劑連接反應(yīng)：λDNA/EcoT14I:由11條DNA片段組成：19329、7743、6223bp、4254、3472、2690、1882、1489、925、421、74bpT4DNA連接酶及其配套的10×連接緩沖液檢測(cè)：0.5×TBE電泳緩沖液6×電泳載樣緩沖液、Goldview、瓊脂糖現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六2、器具：水平式電泳裝置電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī)恒溫水浴鍋（用PCR儀代理）微量移液槍微波爐或電爐紫外透射儀照相機(jī)及其附件現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（一）DNA片段的連接(注：每人一管）取200μl的離心管按下表加入試劑?！靹蚝簏c(diǎn)動(dòng)離心，將溶液甩至管底↓置于已調(diào)好溫度為12℃-14℃PCR儀中↓保溫1-2h后取出↓電泳檢測(cè)樣品代號(hào)成分用量（μl）ddH2O7.0IλDNA/EcoT14I片段10.0f連接緩沖液2.0TT4DNA連接酶1.0總體積20實(shí)驗(yàn)步驟現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（二）DNA連接樣品的電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠的制備：制備2塊1.2%瓊脂糖凝膠（0.48g/40ml）?，F(xiàn)在是36頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（三）加樣及電泳檢測(cè)連接樣品檢測(cè)：λ/EcoT14I樣品5μl（M2）DNA連接樣品：20μl恒壓電泳:130V電泳至溴酚藍(lán)離凝膠外端1-2cm處，大約30-40分鐘觀察:紫外透射儀下觀察電泳結(jié)果，并拍照記錄?，F(xiàn)在是37頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六質(zhì)粒及酶切樣品電泳預(yù)期結(jié)果從左至右：1.λ/EcoT14IDNAMarker2.pUC19質(zhì)粒3.pUC19質(zhì)粒酶切樣品123質(zhì)粒不同構(gòu)型的電泳行為線型DNA超螺旋DNA現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六1234561：λ-EcoT14digest2,3：連接產(chǎn)物4：pUC19質(zhì)粒5,6：酶切產(chǎn)物現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六酶切反應(yīng)注意事項(xiàng)

酶量，反應(yīng)時(shí)間及體積Oneunitofenzymeisdefinedasthequantityneededtocut1μgofDNAin50ulinonehour

反應(yīng)時(shí)間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了,如果酶減少，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（16h)；反應(yīng)體系不應(yīng)太小,常規(guī)的酶切一般要維持在10-50ul。

酶的體積不要超過總體積的10%（甘油應(yīng)在5%以下）。酶的使用：酶應(yīng)永遠(yuǎn)放冰上，應(yīng)是最后一個(gè)被加入到反應(yīng)體系中，用完后及時(shí)放回冰箱

DNA的制備：待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA,去污劑或過多鹽離子等

緩沖液：不同酶需不同離子強(qiáng)度緩沖液，使用前應(yīng)將緩沖液完全溶解并充分混勻。

混勻：很重要，注意不可振蕩反應(yīng)溫度：通常37℃終止反應(yīng)：終止液，熱失活，酚/氯仿抽提星號(hào)活性：在非理想條件下，內(nèi)切酶切割與識(shí)別位點(diǎn)相似但不完全相同的序列。現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六如果遇到酶切不動(dòng)或切不完全，該怎么辦？

酶是否有活性2)模板性質(zhì)是否清楚：酶切效果與DNA的性質(zhì)（線狀，超螺旋狀）、位點(diǎn)數(shù)目、位點(diǎn)左右的序列、甲基化程度、純度等有很大的關(guān)系。對(duì)超螺旋狀DNA完全酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍3)模板純度是否夠4)甲基化程度對(duì)酶的活性是否有影響5)反應(yīng)條件是否合適：溫度，BSA,緩沖溶液，DTT6)酶稀釋和添加方式是否正確：一般要求在最后加酶，提前混合，動(dòng)作要快一些，沒有分裝前的Mix，要求放在冰里，盡快使用現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六其它結(jié)果限制酶切割后的DNA電泳得到的電泳條帶有些擴(kuò)散

有蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合酶切條件不合適有外切核酸酶污染