工業(yè)微生物及來源

工業(yè)微生物及來源第1頁/共41頁模塊一工業(yè)微生物及來源、分離、選育4.生產(chǎn)菌種的獲得；5.育種或選育；第2頁/共41頁一、生物活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選1.般新種分離純化和篩選步驟采樣預(yù)處理增殖或富集培養(yǎng)純種分離性能測定稀釋劃線組織分離初篩復(fù)篩第3頁/共41頁一、生物活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選2.產(chǎn)生目標(biāo)或所需生物活性物質(zhì)的微生物（菌種）的來源土壤、海洋、空氣、某些特定的環(huán)境第4頁/共41頁二、微生物選擇型分離的原理（3）抗生素或試劑；（P32）1.新種的分離1.1預(yù)處理；（P31）1.2施加選擇性壓力分離法；（1）環(huán)境條件：溫度、pH、滲透壓、氧氣等；（2）碳源、氮源（培養(yǎng)基）；（P32）第5頁/共41頁二、微生物選擇型分離的原理（4）培養(yǎng)方法：分批式富集培養(yǎng)（搖瓶培養(yǎng)），恒化式富集培養(yǎng)（連續(xù)培養(yǎng)）（P34）1.3隨機分離法；（P35）（1）抗生素產(chǎn)生菌的篩選；（2）藥理活性化合物(酶抑制劑)的篩選；（3）生長因子產(chǎn)生菌的篩選；上述兩種方法的目的是富集和增殖，使所需微生物在混合物中形成優(yōu)勢，已達到某種程度的初篩效果，便于后續(xù)純種分離。第6頁/共41頁二、微生物選擇型分離的原理

純種分離方法：稀釋分離法、劃線法、組織法。

另一類是較細的單細胞或單孢子分離方法，可達到“菌株純”或“細胞純”的水平。粗放，只能達到“菌落純”

（工業(yè)上常采用）可達到“菌株純”或“細胞純”的水平。需采用專門的儀器設(shè)備，復(fù)雜：顯微操作裝置，簡單：利用培養(yǎng)皿或凹玻片作分離小室進行分離。第7頁/共41頁二、微生物選擇型分離的原理

分離時為提高篩選工作效率，仍要引入各種選擇性壓力。2.對純種進行發(fā)酵條件的摸索和生產(chǎn)試驗（生產(chǎn)性能測定）。此處可加一步產(chǎn)物鑒別此步驟要反復(fù)進行，直至獲得1~3株較好的、適合生產(chǎn)要求的菌株，并進而將其作為育種的出發(fā)菌株。第8頁/共41頁二、微生物選擇型分離的原理（1）生產(chǎn)性能測定分初篩和復(fù)篩兩步進行。（2）初篩階段的主要矛盾：菌株多，工作量大；準(zhǔn)確性是次要矛盾。（3）初篩原則：多選菌株，一個菌株做一個發(fā)酵。（4）復(fù)篩階段：80~90%的菌株在初篩階段被淘汰，

生產(chǎn)性能和準(zhǔn)確性為主要矛盾。5）復(fù)篩原則：一個菌株同時做3~5個發(fā)酵，必要時可連做幾批。應(yīng)把握工作量和準(zhǔn)確性這對矛盾的“度”。第9頁/共41頁三、菌種選育改造菌種，目的：大幅度提高產(chǎn)量，改進質(zhì)量。1.出發(fā)菌株的選擇原則（1）自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果；（2）在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株；三要素：出發(fā)菌株、育種手段、篩選條件。第10頁/共41頁（3）每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高；（4）出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變；（5）要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。第11頁/共41頁2.工業(yè)菌種育種的手段：自然選育（P36）誘變育種（P37~41）雜交育種（P43~48）原生質(zhì)體融合（P48）基因工程育種（P58）第12頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型

與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。MM：能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基。SM：在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)。CM：能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基。如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。第13頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型

篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜1、誘變方法：物理誘變和化學(xué)誘變。第14頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型2、淘汰野生型目的：濃縮缺陷型。采用的手段或方法：野生型MM而缺陷型MM①抗生素法：將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，處于休眠狀態(tài)。第15頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。②菌絲過濾法：適合絲狀菌對于絲狀菌，在MM上會形成菌絲體，就不能通過過濾介質(zhì)，而缺陷型因未生長而能通過濾層。能否濃縮的關(guān)鍵是細胞在MM中生長的情況。細菌或酵母對一些抗生素敏感，加入一定量的抗生素，使活化狀態(tài)的野生型就被殺死，缺陷型因因不能生長繁殖而保存下來。第16頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型3、檢出缺陷型采用的方法：影印法、點種法、夾層法。缺陷型在CM上生長良好，在MM上則不生長，野生型二者均能生長。第17頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型影印法1.將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌；2.將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位；3.將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上；第18頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型4.將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)；5.二平皿相同方位進行比較，可發(fā)現(xiàn)在

MM平皿上長出的菌落少于CM平板上的。MM上未長而相應(yīng)于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。第19頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型點種法夾層法用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。先在培養(yǎng)皿上倒一層M.M.瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的M.M.，培養(yǎng)24h，將長出的野生菌落標(biāo)記。然后倒上一層C.M.瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。第20頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型4、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定生長譜測定的方法：結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。驗證確定是缺陷型后，需確定其缺陷的因子，即生長譜的測定。第21頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型方法一：菌體MM組合營養(yǎng)物將缺陷型菌株培養(yǎng)后，離心收集菌體，制備成細胞懸液，與M.M.培養(yǎng)基（融化并涼至50℃）混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。—個平皿測一個菌。第22頁/共41頁誘變育種舉例-營養(yǎng)缺陷型方法二：組合營養(yǎng)物MM菌體

以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的M.M.培養(yǎng)基混合鋪成平皿。然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置。培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出情況可推知其營養(yǎng)因子。在5～6個平皿上可測20株菌以上。第23頁/共41頁工業(yè)化菌種的要求6.生產(chǎn)特性要符合工藝要求。1.能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物；2.有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強；3.遺傳性能要相對穩(wěn)定；4.不易感染它種微生物或噬菌體；5.產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）；第24頁/共41頁雜交育種利用不同變種的細胞與細胞結(jié)合、染色體的交換、基因的重組來獲得優(yōu)良品種的過程。目的：是把雙親（或多親）的不同遺傳性狀集中到雜種個體中，以創(chuàng)造出具有雙親（或多親）的優(yōu)點，或獲得不同于親代遺傳性狀的雜種。雜交育種的理論基礎(chǔ)：基因重組。雜交育種中最有實踐價值和理論意義：提高了雜種對誘變劑的敏感性。第25頁/共41頁雜交育種舉例–霉菌的體細胞雜交準(zhǔn)性生殖：霉菌雜交：指通過體細胞的核融合和遺傳因子的重組，即通過準(zhǔn)性過程而不是通過性細胞的融合。工業(yè)上遇到的霉菌大多數(shù)不產(chǎn)生有性孢子，沒有典型的有性過程。細胞雜交得到的分生孢子還是無性孢子，形態(tài)上無特殊變化。準(zhǔn)性循環(huán)（體細胞雜交）的三個連續(xù)過程，見下圖。第26頁/共41頁

圖1

霉菌的準(zhǔn)性循環(huán)第27頁/共41頁霉菌的體細胞雜交1.選擇直接親本原始親本用來進行雜交的兩個野生型菌株。直接親本原始親本經(jīng)誘變后得到各種突變型菌株，若用來作為形成異核體的親本。2.異核體的形成兩株遺傳標(biāo)記不同的菌株，經(jīng)過菌絲間的吻合，細胞質(zhì)和核進行交流，形成異核菌絲體（簡稱異核體）。第28頁/共41頁霉菌的體細胞雜交3.雜合二倍體的形成是準(zhǔn)性重組的主要部分，也是雜交育種的關(guān)鍵。此時一條菌絲里含有兩種遺傳性狀不同的細胞核，共同生活在均一的細胞質(zhì)里。異核體具有野生型的功能，并非所有的菌株都有形成異核體的能力，只有彼此間具有感受性才能形成異核體。技術(shù)見（P47）雜合二倍體本身不僅具備了雜種的特性，而且隨著其染色體或基因的重組和分離，還能形成更多類型的雜種（重組體分離子）為雜交育種和遺傳分析提供了豐富的材料。第29頁/共41頁霉菌的體細胞雜交

雜合二倍體的形成方法見（P47）。4.染色體交換及單倍化（體細胞重組）雜合二倍體是相對穩(wěn)定的。重組型分離子即重組體，在二倍體菌落中表現(xiàn)為角變和扇形斑點。分離子檢出方法見（P47）有極少數(shù)的體細胞在它們無性繁殖的有絲分裂過程中偶然發(fā)生染色體交換（體細胞交換）和染色體單倍化（不同于減數(shù)分裂），產(chǎn)生單倍或雙倍的分離子。表型上可分為親本型分離子和重組型分離子。第30頁/共41頁霉菌的體細胞雜交

準(zhǔn)性生殖和有性生殖的相同點：相類似遺傳現(xiàn)象：核融合、形成雜合二倍體、染色體再分離、同源染色體交換、出現(xiàn)重組體；均能導(dǎo)致基因重組。不同點：有性生殖通過減數(shù)分裂，準(zhǔn)性生殖通過體細胞交換和單倍化。青霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)黃青霉與灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉雙重營養(yǎng)缺陷型間準(zhǔn)性雜交見圖2第31頁/共41頁圖2-2青霉菌雜交育種實驗操作步驟第32頁/共41頁原生質(zhì)體融合技術(shù)（P48）原生質(zhì)體制備（破壁）

原生質(zhì)體融合（化學(xué)融合、電融合）

原生質(zhì)體再生（高滲）

融合子的檢出（遺傳標(biāo)記、選擇性培養(yǎng)基）第33頁/共41頁重組DNA技術(shù)：DNA重組技術(shù)、基因工程（P49~58）是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)；使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。重組DNA技術(shù)的三大基本元件：供體、受體、載體?；蚬こ淌侵钢亟MDNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。第34頁/共41頁上游技術(shù)：基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；下游技術(shù)：基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，基因產(chǎn)物的分離純化過程。

常用的獲得目的基因的方法：鳥槍法、cDNA法、人工合成（P52）。稱之謂“切”。載體：質(zhì)粒、噬菌體、其它載體。（P53~54）基因與載體的連接技術(shù)：黏性末端連接和平頭連接（鈍端連接）。稱之謂“接”。（P54）第35頁/共41頁接頭