離心分離和沉淀分離演示文稿

離心分離和沉淀分離演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五（優(yōu)選）離心分離和沉淀分離現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五1離心沉降原理球形粒子沉降在離心力場(chǎng)中現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五1離心沉降原理Ｆ<３０００常速離心機(jī)Ｆ＝３０００-５００００中速離心機(jī)Ｆ≥５００００高速離心

現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五離心機(jī)的種類(lèi)與用途按速度和離心力：1、常速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min),相對(duì)離心力(RCF)104g以下,用于細(xì)胞、菌體和培養(yǎng)基殘?jiān)确蛛x；2、高速（冷凍）離心機(jī)

1×104-2.5×104rpm，相對(duì)離心力104~105g,用于細(xì)胞碎片、較大細(xì)胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速2.5-8×104rpm，相對(duì)離心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、病毒分離純化；檢測(cè)純度；沉降系數(shù)和相對(duì)分子量測(cè)定等?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五瓶式離心機(jī)1）斜角式離心機(jī)是一類(lèi)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室常用離心機(jī)，指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子；角度越大，沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時(shí)，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積。現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五2）平拋式離心機(jī)平拋式離心機(jī)一類(lèi)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室常用的低中速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速一般在3000-6000rpm。轉(zhuǎn)子活動(dòng)管套內(nèi)的離心管，靜止時(shí)垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子軸向移動(dòng)。樣品便于收集受振動(dòng)和變速攪亂后對(duì)流現(xiàn)象小，但轉(zhuǎn)頭結(jié)構(gòu)復(fù)雜，最高轉(zhuǎn)速相對(duì)要低容量也小一些。

現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五平拋式離心機(jī)轉(zhuǎn)子現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五2離心沉降設(shè)備瓶式離心機(jī)也稱(chēng)平拋式離心機(jī)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室常用的低，中速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速一般在3000-6000rpm?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五2離心沉降設(shè)備管式離心機(jī)液-液分離；液-固分離結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)速很高可連續(xù)操作（液-液）現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五2離心沉降設(shè)備碟式離心機(jī)固體的沉降距離極短，分離效果較好。碟片間的距離一般為0.5~2.5mm,與被分離物料的性質(zhì)有關(guān)。液-液分離；液-固分離連續(xù)操作現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五2離心沉降設(shè)備多室式離心機(jī)增加了沉降面積，減少了沉降距離同時(shí)還有粒度篩分的作用常用于抗菌素液－液萃取分離間歇式生產(chǎn)現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五管式離心機(jī)3離心沉降的計(jì)算ＨＲ０Ｒ１rz管壁現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五沉淀分離現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五概述

沉淀（定義）

是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程。沉淀具有選擇性

有選擇地沉淀雜質(zhì)有選擇地沉淀所需成分優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高缺點(diǎn)：針對(duì)復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五概述

沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾和離心（除去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片）以后進(jìn)行。操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小時(shí)，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進(jìn)行：現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)是兩性高分子電解質(zhì)在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢(shì)，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成?，F(xiàn)在是17頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五概述沉淀法操步驟：沉淀劑粒子生長(zhǎng)收集沉淀物過(guò)濾離心現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五概述沉淀法（1）鹽析法；（2）等電點(diǎn)沉淀法；（3）有機(jī)溶劑沉淀法；（4）非離子型聚合物沉淀法；（5）聚電解質(zhì)沉淀法；（6）高價(jià)金屬離子沉淀法等。除第（3）種有機(jī)溶劑沉淀法也能適用于抗生素等小分子外，其他各種方法只適用蛋白質(zhì)等大分子。分類(lèi)現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)鹽析因此，可通過(guò)降低蛋白質(zhì)周?chē)乃瘜雍碗p電層厚度（ζ電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素水化層雙電層使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液靜電排斥作用現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)鹽析中性鹽蛋白質(zhì)脫水中和電荷沉淀現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五鹽析法機(jī)理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周?chē)乃訙p弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動(dòng)碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀?，F(xiàn)在是23頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)鹽析

現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五鹽析用鹽的選擇鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來(lái)源豐富、經(jīng)濟(jì)現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五鹽析操作蛋白質(zhì)鹽析

①直接加入固體(NH4)2SO4粉末，工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢瑁蛊渫耆芙夂头乐咕植繚舛冗^(guò)高；②是加入硫酸銨飽和溶液，在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中，或(NH4)2SO4濃度不需太高時(shí)，可采用這種方式，它可防止溶液局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)鹽析陰離子：檸檬酸＞PO43-

＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-陽(yáng)離子：NH4+＞K+＞Na+＞高價(jià)陽(yáng)離子硫酸銨：（1）價(jià)廉；（2）溶解度大，穩(wěn)定蛋白質(zhì)；（3）水解變酸；（4）高pH釋氨，腐蝕；（5）殘留產(chǎn)品有影響。鹽析效果現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五影響因素蛋白質(zhì)鹽析pH變化溫度變化等電點(diǎn)附近有極小值隨溫度升高減小，熱促失水膜現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五lgS現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)鹽析鹽析注意事項(xiàng)：

(1)穩(wěn)定pH用磷酸緩沖液（2）硫酸銨加入后體積變大（3）選擇飽和度（4）分步鹽析（5）初始蛋白濃度現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質(zhì)的溶解度，g/L;I－離子強(qiáng)度，

I=1/2∑mizi2mi—離子i的摩爾濃度；Zi—所帶電荷β—常數(shù)，圖中截距Ks—鹽析常數(shù)，圖中直線斜率Cohn經(jīng)驗(yàn)式

蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五等電點(diǎn)沉淀法原理：調(diào)pH至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀。適用于疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五pH=pI現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五等電點(diǎn)沉淀法（1）適用于疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)（2）中性鹽濃度增大時(shí)，等電點(diǎn)向偏酸方向移動(dòng)，同時(shí)最低溶解度會(huì)有所增大。（3）無(wú)機(jī)酸通常價(jià)格便宜，無(wú)毒（4）蛋白質(zhì)對(duì)低pH敏感，易失活操作注意事項(xiàng)現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五等電點(diǎn)沉淀實(shí)例從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì)(pI=3．O)。工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI＝5.3)時(shí)：先調(diào)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)(同時(shí)加入一定濃度的有機(jī)溶劑以提高沉淀效果)?，F(xiàn)在是38頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五等電點(diǎn)沉淀法細(xì)胞色素C洗脫液（離交）+硫酸胺（飽和度86%）低溫離心上清液調(diào)pH4.8-5.1產(chǎn)物↓沉淀（雜蛋白）現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五有機(jī)溶劑沉淀法

概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。優(yōu)點(diǎn)在于：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過(guò)濾較為容易；缺點(diǎn)是1）對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2）操作要求在低溫下進(jìn)行。3）成本高現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五A降低溶劑介電常數(shù).B破壞水化膜：C相反力：有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，從蛋白質(zhì)分子周?chē)乃瘜又袏Z走了水分子，破壞水化層疏水基團(tuán)暴露并有機(jī)溶劑疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五降低介電常數(shù)破壞水化膜現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五常用的有機(jī)溶劑沉析劑選擇依據(jù)：水溶性要好介電常數(shù)要小致變性作用要?。状迹┒拘砸　]發(fā)性適中容易獲取沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀劑乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無(wú)毒，常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五溫度

使用有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，操作必須在低溫下進(jìn)行，有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素pH值：

pH多控制在待沉蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期五

舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的提取工藝研究

α-淀粉酶（米曲霉）菌體+水過(guò)濾水抽提清液

加乙醇（70%）攪拌α-淀粉酶↓

*pH影響收率%酶活收率酶活

6.5pH*適宜的pH5.6~6.0

*

溫度影響

收率%