主要禽病實驗室檢測方法及分析

主要禽病實驗室檢測方法及分析第1頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三主要禽病的實驗室檢測方法及結果分析張國中（中國農業(yè)大學）2011年4月23日第2頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（一）血清學檢測方法

1、免疫血清學技術抗原與抗體在體內（外）均可發(fā)生特異性結合反應，因為抗體主要來自于血清，在體外進行的抗原抗體反應稱為血清學反應或免疫血清學技術。一、常用的實驗室檢測方法3第3頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三血清學反應的一般特點高度特異性反應可逆性反應二階段性影響反應的因素4第4頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三血清學反應的應用抗原抗體的快速檢測微生物的鑒定與分析生物活性物質的超微定量抗原抗體在細胞和亞細胞水平定位5第5頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三2、血清學反應類型及常用試驗方法反應類型常用試驗名稱凝集試驗直接凝集試驗→平板凝集試驗（SPA）血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）沉淀試驗瓊脂免疫擴散試驗（AGP）中和試驗病毒中和試驗（VN）標記抗體技術酶標記技術→酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）6第6頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（1）平板凝集試驗（SPA）基本原理：細菌、紅細胞等顆粒狀抗原與相應抗血清在電解質存在情況下，產生可見的顆粒凝集現(xiàn)象。主要應用：雞白?。⊿P）支原體（MG/MS）7第7頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖1平板凝集試驗檢測結果第8頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（2）血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）基本原理：某些病毒（如NDV）能夠凝集特定種類動物的紅細胞，此即紅細胞凝集現(xiàn)象。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可以被特異性抗血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗。主要應用：新城疫（ND）禽流感（AI）產蛋下降綜合癥（EDS）雞傳染性支氣管炎（IB）9第9頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖2血凝抑制試驗檢測結果G.Cattoli（OIE）第10頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（3）瓊脂免疫擴散試驗（AGP）基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、細菌裂解液）與相應抗體結合,在電解質存在情況下，產生可見的沉淀物。主要應用：雞馬立克氏病病毒（MDV）雞痘病毒（FPV）11第11頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖3瓊脂擴散試驗檢測結果1.抗原；2.陽性對照；3-6.待檢血清；7.陰性對照第12頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（4）病毒中和試驗（VN）基本原理：抗原與相應的抗血清按適當比例混合作用后，可被中和而失去感染實驗動物、組織細胞或雞胚的能力。主要應用：雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的血清分型。13第13頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖4采用雞胚接種進行IBV分離空白對照病毒接種第14頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖5采用中和試驗對疑似IBV分離物進行鑒定與分型空白對照病毒接種病毒+抗血清第15頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）基本原理：抗原抗體反應的特異性酶促反應的高效性使抗原（或抗體）結合到某種固相載體表面并保持其免疫活性；使抗原（或抗體）與某種酶連接成酶標物，這種酶標抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留酶的活性。16第16頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三主要應用：多種禽病檢測抗體檢測最常用ELISA方法：間接法，是利用酶標記的抗抗體（一般為抗雞IgG）檢測已與固相抗原結合的抗體。17第17頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖6間接ELISA方法測抗體的基本原理示意圖固相載體包被抗原待檢抗體酶標二抗底物顯色第18頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三考慮血清學檢測的目的血清樣品的采集方法采集血清樣品的數量血清樣品的標記血清樣品的貯藏及運輸3、血清學檢測應注意的問題19第19頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三1、病原分離鑒定（1）定義：指通過人工培養(yǎng)的方法分離出病原體的過程。（二）病原學檢測方法20第20頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（2）病原分離主要目的進行疾病診斷疾病確診的黃金方法病原學研究的基礎21第21頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（3）病原分離方法細菌分離培養(yǎng)：各種培養(yǎng)基病毒分離鑒定：雞胚、細胞或實驗動物接種22第22頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（4）進行病毒分離應注意的問題樣品采集時間采集樣品種類樣品貯藏及運輸常見接種途徑常用鑒定方法23第23頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三2、聚合酶鏈式反應（PCR）（1）主要目的：通過對特異性基因片段的檢測達到檢測病原體的目的。（2）優(yōu)缺點：方便快捷、存在假陽（陰）性24第24頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖7常規(guī)RT-PCR檢測結果（電泳圖）第25頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三3、其它病原學檢測方法（1）血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗（2）瓊脂免疫擴散試驗（AGP）（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（4）膠體金試紙條檢測（5）動物實驗檢查26第26頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三1、雛雞母源抗體檢查（1-3日齡）（1）了解原產地的免疫種類了解原產地易發(fā)病種類及保護性水平確定需根據當地情況加免的疫苗根據抗體反應追蹤是否有過感染二、實驗室監(jiān)測方案的制定27第27頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（2）了解母源抗體水平根據母源抗體水平及各種疫病母源抗體半衰期合理確定疫苗首免時間了解雛雞免疫保護能力，便于疫病診斷28第28頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三2、免疫檢查（1）免疫前檢查目的是了解免前抗體水平、決定免疫時間和進行免疫效果評價。初免前檢查再免前檢查29第29頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（2）免疫后檢查目的是檢查免疫效果，評價免疫成功或失敗，盡快采取相應措施確保生產安全。通常應選擇免疫后14-21天進行。30第30頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（3）定期檢查目的是規(guī)律性檢查抗體消長水平以便及時采取補救措施，分析各種免疫之間的相關性，調整免疫程序。31第31頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（4）重要節(jié)點檢查30~50d檢查（檢查前幾次免疫效果）開產前檢查（產蛋期及雛雞保護性抗體需求）36~40W檢查（確定抗體水平、適時補免）32第32頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三3、生產發(fā)生變動時的檢查（1）日常規(guī)律性抗體監(jiān)測做為發(fā)病時檢查的參考數據做為雞群抵抗力的依據，指示病因分析方向做為流行病學分析數據，利于發(fā)現(xiàn)病原變異33第33頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（2）雙份血清檢測鑒于發(fā)病后抗體常有明顯升高，雙份血清抗體值對比分析有很好的診斷價值。34第34頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（3）抗原檢測某些情況下，抗原檢測可以直接證實感染狀況的存在。35第35頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（4）未免疫雞群抗體檢測未免疫雞群某疾病抗體的出現(xiàn)，特別注意雛雞母源抗體消失后抗體的再出現(xiàn)以及隨日齡增加而抗體持續(xù)上升的現(xiàn)象，這對疾病診斷十分重要。36第36頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三4、重要疫病流行動態(tài)分析流行動態(tài)分析對生產企業(yè)來說，開展具有一定的難度，但對重要疫病，尤其是重點進行免疫防控的疫病仍然值得重視，對長期的流行資料進行分析，會得到極為有益的技術支持。37第37頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三流行動態(tài)分析需要進行大量工作，除抗體監(jiān)測外，必需配合針對性的實驗室研究工作，如病原分離鑒定、動物實驗和必要的分子生物學研究。38第38頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三1、HI檢測結果與分析（1）常見HI檢測結果1-3d15-25d25-35d35-50d>50d開產前36w左右≥40wH5N125-720-320-423-526-727-925-627-9H9N225-920-323-524-727-829-1226-729-11ND25-920-323-525-827-1029-1227-829-12三、重要疫病的常見檢查結果與分析39第39頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖8種雞開產前NDV抗體檢測情況第40頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（2）免疫抗體空檔期15-25d是母源抗體逐漸消失，新的免疫抗體尚未建立的時期野毒侵襲大多發(fā)生于此，一般18-25d多發(fā)空檔期隨免疫（程序和疫苗）成功達到最短41第41頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖9NDV母源抗體衰減情況第42頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖1015-30日齡雛雞NDV抗體檢測情況第43頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（3）HI檢查的抗體離散度在4lg2內是允許范圍大于4lg2的基本原因初免時母源抗體水平參差不齊免疫成功率不高-漏免太多疫苗質量不好二免后離散度應達到要求44第44頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（4）抗體保護臨界值通過攻毒試驗加以驗證的結果AIV要求≥26NDV要求≥28-10臨界值是針對有效保護對等而言，即疫苗和流行毒株有良好的相關性。當流行毒株變異而疫苗株保護性不足時，原有臨界值在一定程度上失去意義，需要新確立或提高臨界值水平。45第45頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（5）診斷試劑問題抗原問題：抗原不純（影響HA的確定）抗原制備毒株和流行毒株存在明顯差異陽性血清問題：陽性血清不純46第46頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（6）診斷指標H5N1雙份血清檢測：應用常規(guī)

Re-4、Re-5苗免疫情況下，如果知道發(fā)病前抗體水平，則發(fā)病后10-14d可檢測出Re-4、Re-5抗體滴度上升22-3。未免相應疫苗的情況下，檢測變異株抗體達到26-9有診斷價值。47第47頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖11某肉種雞群發(fā)生H5感染前后抗體檢測結果（38W發(fā)生，2W產蛋率75%→5%，死淘20%）第48頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖12某肉種雞群H5感染后變異株抗體檢測結果（換羽24W發(fā)生，降蛋10%，累計死亡率5%）第49頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三H9N2產蛋雞發(fā)病后10-14天，HI抗體20%以上達到212以上有診斷價值。雛雞20-30dHI抗體達到26-9有診斷價值。50第50頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三ND產蛋雞發(fā)病后10-14d，HI抗體≥213有診斷價值。雛雞20-35dHI抗體達到26-9有診斷價值。51第51頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖13某肉種雞群發(fā)生NDV感染后抗體檢測結果第52頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三HI診斷應注意的問題HI診斷應結合臨床表現(xiàn)，當臨床表現(xiàn)無異常而檢測結果異常時往往是檢測結果出了錯，應提高警惕。53第53頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三2、平板凝集試驗（SPA）檢測結果與分析（1）可用于MG、MS、SP檢查（2）可進行血清平板和全血平板，相對來說血清平板更準確和易于判斷。54第54頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（3）SPA準確率相對較差，假陽性率高，一般群體檢查超過30%以上陽性才有確實群體感染的診斷意義。（4）國內產品和國外產品特異性上有一定差距。55第55頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三3、瓊脂擴散試驗（AGP）檢測結果與分析（1）可用于MD、POX和IC

（2）對MD可進行抗體、抗原兩種檢測50d左右，50%以上抗體陽性預示疫苗反應正常用羽髓做瓊擴有發(fā)病診斷價值56第56頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（3）POX常不用檢測，通過觀察接種部位反應可了解免疫效果，觀察臨床癥狀進行疫病診斷。（4）IC的瓊擴試劑很少，可從國外進口或選用日本北里所的間接血凝試劑。57第57頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三4、ELISA檢測結果與分析（1）目前可應用ELISA檢測的疾病ND、AIMG、MS、SPIB、IBD、REO、AE、RE、ILT、CIAALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag58第58頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（2）常見ELISA檢測結果1-3d15-25d25-35d>50d開產前產蛋期IB2000-80000-10001000-20002000-80002000-150002000-15000IBD2000-80000-15002000-40004000-100004000-100004000-12000REO2000-50000-5000-20002000-60002000-150002000-15000ILT2000-30000-10000-5002000-40002000-60002000-6000AE500-20000-5000-300300-6000300-8000500-8000CIA+（<0.3）+/--+/-+（<0.1）+（<0.1）59第59頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（3）ELISA試劑盒之間的差異每種試劑盒都有自己的特定的陽性值及敏感范圍。原則上同一疾病不同廠家ELISA試劑盒之間沒有直接可比性，除非做過平行對比研究。同一病原的抗體檢測可能針對的抗原表位不同會得到不同結果，要格外慎重。60第60頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三（4）對REV檢測結果的認識REV抗體檢測結果應該為陰性。20-30d檢出陽性率超過20％則預示雞群可能存在嚴重免疫抑制問題。61第61頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三當1-15d檢出100％陽性率時，可能大雞免疫或污染過；檢出少于5％陽性率時，可能種雞是污染群或假陽性結果。超過30d以上的檢測通常都只能做為污染的佐證，但至少20%以上才有生產影響意義。62第62頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖14某雞場免疫禽痘疫苗后的REV抗體檢測結果（2W免疫，8W和11W檢測）

第63頁，共74頁，2023年，2月20日，星期三圖15某雞痘重組疫苗污染REV的檢測情況第64頁，共74頁，2023年，2月20日