免疫細胞標志與功能檢測技術

免疫細胞標志與功能檢測技術第1頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三掌握：免疫細胞的分離;淋巴細胞功能檢測熟悉：免疫細胞表面標志和功能檢測的臨床

應用;淋巴細胞表面標志及亞群分類；了解：其他免疫細胞功能檢測技術；檢測的

臨床應用。第2頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一、免疫細胞的分離二、淋巴細胞標志及亞群分類三、抗原提呈細胞的表面標志四、淋巴細胞的功能檢測五、其他免疫細胞功能檢測技術六、免疫細胞表面標志和功能檢測的臨床應用第3頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第4頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一、外周血單個核細胞分離二、淋巴細胞的分離三、T、B細胞和T細胞亞群的分離四、不同分離方法的評價第一節(jié)免疫細胞的分離掌握第5頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三外周血單個核細胞(perpheralbloodmononuclearcells,PBMC)：包括淋巴細胞和單核細胞。一、外周血單個核細胞分離掌握第6頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.不同細胞密度不同2.不同細胞表面生物學特性不同3.不同細胞表面分化抗原不同細胞分離基本原理了解第7頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三紅細胞和粒細胞密度為1.092-1.093單個核細胞密度為1.075-1.090

選擇比重為1.075-1.090介質分離PBMC不同細胞密度不同熟悉第8頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三對分離介質的要求1.對細胞無毒2.基本等滲3.不溶于血漿等分離物質4.有要求的比重2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液+1份34%泛影葡胺比重為1.077±0.002熟悉第9頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三聚蔗糖泛影葡胺--Ficoll分離液原理：單次差速密度梯度離心的分離法組成：2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液+1份34%泛影葡胺生理鹽水溶液。比重：1.077±0.001(最佳)

掌握第10頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

1.077±0.001的分層液可將細胞分離紅細胞：1.093粒細胞：1.092單個核細胞1.076—1.090

第11頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第12頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

密度梯度離心(Ficoll)離心

細胞純度95%；細胞收率80%；淋巴細胞90%--95%

第13頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.貼壁粘附法

2.吸附柱過濾法:

將PBMC加入葡聚糖凝膠SephadexG-10中，從柱上洗脫下來的主要是淋巴細胞。3.Percoll分離液法：經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮（PVP)處理的硅膠顆粒。目的--去除單核細胞二、淋巴細胞分離掌握第14頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

死細胞、血小板

單核細胞

淋巴細胞

粒細胞紅細胞

Percoll：經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮（PVP)處理的硅膠顆粒。第15頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三(一)磁性微球分離法(二)熒光激活細胞分離儀分離法

三、T、B細胞和T細胞亞群的分離熟悉磁珠高分子材料第16頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三磁珠大小可以選擇第17頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三磁性微球分離法細胞分選過程第18頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

第19頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第20頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三大小免疫磁珠分離細胞的特點比較

比較項目大磁珠小磁珠對細胞的影響對細胞造成機械壓力，影響其生物學活性，不利于分離后培養(yǎng)。對細胞溫和，不影響分離細胞的后續(xù)培養(yǎng)。對流式細胞儀的影響阻塞流式細胞儀的噴嘴，影響散射光。可直接上流式細胞儀檢測，不影響散射光。分離條件要求技術簡單，分離可在試管中完成。需要很強的磁場來分離細胞。收率得率高。得率不高。純度純度低。純度高。分離時間分離速度快。分離速度慢。分離成本成本低。需要很強的磁場來分離，需要一次性分離柱，不能在普通試管第21頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三免疫磁珠細胞分選裝置第22頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三全自動細胞分選系統(tǒng)

第23頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

熒光激活細胞分離儀分離法

第24頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三流式細胞分析儀第25頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三四、不同細胞分離方法的綜合評價早期：根據(jù)不同免疫細胞的物理屬性和生物學屬性進行分離近期：利用細胞表面標志進行分離了解第26頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.分離外周血單個核細胞，單次差速密度梯度離心法常用分層液是（）A明膠B右旋糖酐CFicoll分層液DPercoll分層液E葡聚糖2.Ficoll液單次密度梯度離心后外周血細胞分布由上至下依次為（）A單個核細胞、血小板和血漿、粒細胞、紅細胞B血小板和血漿、粒細胞、單個核細胞、紅細胞C血小板和血漿、單個核細胞、粒細胞、紅細胞D血小板和血漿、單個核細胞、紅細胞、粒細胞E血小板和血漿、紅細胞、單個核細胞、粒細胞用玻璃纖3.維或葡聚糖凝膠Sephadex-G10柱分離細胞時，從柱上洗脫下的細胞主要是()A．粒細胞B．淋巴細胞C．單核細胞D．T細胞E．B細胞

CCB第27頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三4.采用Ficoll密度梯度分離法分離得到的細胞主要為（）A單核細胞和粒細胞B單核細胞C淋巴細胞D淋巴細胞和單核細胞E淋巴細胞和粒細胞

5.Percoll分離液的主要成分是()A．聚蔗糖B．泛影葡胺C．聚乙二醇D．聚乙烯吡咯烷酮E．經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒6.分離人外周血淋巴細胞分層液的最佳密度為()A.1.030B.1.035C.1.092D.1.020E.1.0777.Ficoll淋巴細胞分離液的主要成分是()A．聚蔗糖B．泛影葡胺C．聚乙二醇D．聚蔗糖+泛影葡胺E．聚蔗糖+聚乙二醇DEED第28頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)

淋巴細胞標志及亞群分類第29頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三細胞表面分化抗原(ClusterofdifferentiationCD)CD1a------CD350第30頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三(一)CD3+CD4+CD8-輔助性T細胞(Th)

CD3+CD4+CD30-Th1CD3+CD4+CD30+Th2(二)CD3+CD4-CD8+細胞毒性T細胞(CTL)(三)調節(jié)性T細胞CD4+CD25+Foxp3+

Tr1–IL-10Th3–TFG-β一、T細胞表面標志及亞群熟悉第31頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三CD4+Th細胞亞群分化的調節(jié)作用第32頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三CD抗原CD2CD3CD4CD8CD25CD28CD40L特異性全部T細胞和部分NK細胞(E受體)

成熟T細胞(特征性標志)輔助性T細胞(HIV受體)細胞毒性T細胞活化T細胞(IL-2R)T細胞活化T細胞

T細胞表面主要CD抗原及其特性第33頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三mIg(鑒定B細胞的指標)Fc受體補體受體EB病毒受體CD分子:CD19小鼠紅細胞受體二、B細胞表面標志熟悉分類:B1(CD19+CD5+)B2(CD19+CD5-)第34頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三B-1細胞和B-2細胞的異同第35頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三CD抗原CD21CD35CD40CD80/86CD19/CD5

特異性

EB病毒受體活化B細胞與CD40L結合活化B細胞與T細胞CD28結合，活化T細胞

B1雙陽；B2僅為CD19+

B細胞表面主要CD抗原及其特性第36頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三CD3-CD56+CD16+三、NK細胞表面標志（naturekillercell,NK)熟悉第37頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三復習1.對細胞液分離的要求？2.從PBMC中得到淋巴細胞的方法？3.成熟T細胞表面主要標志？4.B細胞根據(jù)什么主要標志分為何種亞群？第38頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三抗原提呈類細胞表面標志第三節(jié)抗原提呈細胞的表面標志CD1a,CD11c,CD83第39頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一、單核-吞噬細胞系統(tǒng)組織部位細胞名稱骨髓干細胞—單核母細胞—前單核細胞骨髓和血液單核細胞各種組織組織細胞（結締組織）,枯否細胞（肝）（巨噬細胞）破骨細胞（骨）、小膠質細胞（神經(jīng)組織）、表面標志:CD14熟悉第40頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三二、樹突狀細胞（dendriticcell)抗原提呈能力最強DC的共同特征包括：①形態(tài)上呈樹突狀，胞質內存在特異性Birbeck顆粒狀結構②表達CD1a、高水平MHC-Ⅱ類抗原和多種輔助分子③吞噬功能較低④可有效誘導巢居的靜息性幼稚T細胞發(fā)生增殖熟悉第41頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.用抗人CD3單克隆抗體檢測T淋巴細胞，其結果代表（）AT淋巴細胞總數(shù)BTh細胞數(shù)CTs細胞數(shù)DCD4T細胞數(shù)ECD8T細胞數(shù)2.下列指標可以評價AIDS病人的細胞免疫功能的是（）ACD2/CD3細胞比值BCD3/CD4細胞比值CCD3/CD8細胞比值DCD4/CD8細胞比值ECD2/CD4細胞比值3.能與SRBC結合形成E花環(huán)的細胞主要是()A．T細胞B．B細胞C．單核細胞D．粒細胞E．血小板

ADA第42頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三4.B細胞重要表面標志不包括（）A膜免疫球蛋白（SmIg）BEB病毒受體CE受體D補體受體D小鼠紅細胞受體5.

NK細胞特有的表面抗原是()A.CD2B.CD16C.無特異的表面抗原D.CD23E.CD566.單核巨噬細胞系統(tǒng)細胞的表面標志()A．CD2B．CD16C．CD14

D．CD16E．CD197.外周成熟的休止B細胞分如下亞群()A.CD4+細胞B.CD4-細胞C.CD8+細胞D.CD8-細胞E.B1細胞和B2細胞CCCE第43頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)

淋巴細胞功能檢測T細胞（負責細胞免疫功能）B細胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK細胞（非特異性免疫作用）

第44頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一、T細胞功能檢測(一)T細胞增殖試驗(二)抗原特異性T細胞增值試驗(三)MHC-肽四聚體技術(四)T細胞分泌功能測定(五)T細胞介導的細胞毒試驗(六)體內試驗第45頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.原理淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質疏松（一）T淋巴細胞增殖試驗

---T細胞轉化實驗掌握第46頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三T細胞外來物質細胞內大分子物質的合成增加T細胞形態(tài)變化絲裂原：非抗原性刺激物

PHA、ConA、PWM抗原性刺激物：PPD(purifiedproteinderivative)同位素法形態(tài)法第47頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三標本：外周血單個核細胞37℃72h+取培養(yǎng)細胞涂片染色鏡檢觀察細胞形態(tài)學改變PHA無PHA刺激物：常用PHA（1）形態(tài)學檢查法第48頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三未轉化和轉化淋巴細胞的形態(tài)特征轉化的淋巴細胞未轉化的淋巴細胞淋巴母細胞過渡型細胞大小(直徑μm)12-2012-166-8核大小、染色質增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1-4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第49頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三第50頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三淋巴細胞標志及功能檢測龔道科2002.4第51頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三正常轉化率:60%-80%;

小于50%為降低第52頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便易行，適于基層實驗室應用。缺點：判斷結果易受主觀因素影響，重復性和準確性差。

方法學評價：第53頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三外周血單個核細胞37℃56h

+收集培養(yǎng)細胞液體閃爍器計數(shù)cpm加入3H-TdRPHA無PHA37℃16h（2）3H-TdR摻入法第54頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀強，重復性好。缺點：但需一定設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。SI=刺激指數(shù)PHA刺激管cpm均值

對照管cpm均值第55頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三(3)MTT比色法

MTT（噻唑鹽）在活細胞內被線粒體琥珀酸脫氫酶還原成藍黑色(甲臢）物質，與細胞增殖呈正相關。第56頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三方法學評價：優(yōu)點：操作簡便，無放射性污染缺點：敏感性不及放射性核素法

第57頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

感染性疾病，T細胞會形成對病原微生物的免疫記憶，在體外分離到T細胞后，培養(yǎng)增殖T細胞的同時加入相應病原的特異抗原進行刺激，激活該細胞的記憶，有記憶的細胞會分泌γ-干擾素，通過檢測γ-干擾素的量可以反映T細胞情況。（二）抗原特異性T細胞增值試驗了解第58頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

通過TCR與MHC-肽的特異性相互作用，來檢測抗原特異的T細胞，了解機體的免疫狀況。（三）MHC-肽四聚體技術了解第59頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

免疫學、細胞生物學及分子生物學技術分別檢測細胞因子含量、生物學活性或基因表達水平。（四）T細胞分泌功能測定了解第60頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三1.原理靶細胞抗原T細胞

觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞（五）T細胞介導的細胞毒試驗熟悉第61頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三形態(tài)學方法：淋巴細胞+腫瘤細胞計數(shù)殘留腫瘤細胞同位素法：淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放γ計數(shù)儀測定51Cr放射活性意義：判斷腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力

2.方法第62頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三(一)特異性抗原皮膚試驗(OT)(二)PHA皮膚試驗(六)體內試驗了解第63頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗二、B細胞功能檢測了解第64頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三SRBC取出脾細胞，加入SRBC及補體4天37℃0.7%瓊脂溶液37℃

溶血溶血空斑試驗1.原理第65頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三一個溶血空斑表示一個抗體形成細胞。溶血空斑的大小表示抗體形成的量。第66頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三測定藥物或手術對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機體體液免疫狀態(tài)

臨床應用與評價第67頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三染色計數(shù)離心取上清測LDH形態(tài)學法酶釋放法放射性核素釋放法溶解靶胞細常用靶細胞:人K562細胞株鼠YAC-1

三、NK細胞活性測定熟悉

測放射活性第68頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三方法及原理：靶細胞效應細胞

靶細胞死亡可被臺盼蘭染色形態(tài)法釋放胞內酶酶釋法乳酸脫氫酶堿性磷酸酶簡便易于操作

受主觀因素響大無法計數(shù)輕微損傷的細胞經(jīng)濟、快速、簡便敏感度低本底較高第69頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

一、中性粒細胞功能檢測技術

二、巨噬細胞功能檢測技術第五節(jié)其他免疫細胞功能檢測技術了解第70頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

趨化

吞噬

胞內殺滅作用

吞噬細胞的功能熟悉第71頁，共80頁，2023年，2月20日，星期三

趨化功能檢測吞噬