ev病毒c亞型重組病毒樣

EV71病毒C4亞型重組病毒樣顆粒誘導的中和抗體抑制吸附前及吸附后的感染。研究生：王新剛導師：孟繼鴻教授精選課件精選課件前言：EV71是小RNA病毒家族中的腸道病毒屬，擁有大約7.4kb的單正鏈RNA，正二十面體衣殼。病毒基因組非結(jié)構(gòu)基因P2和P3區(qū)

結(jié)構(gòu)基因P1區(qū)VP1、VP0、VP3。

VP2和VP4。病毒蛋白酶3CD空病毒衣殼精選課件EV71是手足口病的病原體，手足口病發(fā)生于5歲以內(nèi)的兒童，過去幾年里，在遠東地區(qū)如，中國、越南、韓國呈暴發(fā)流行，引起嚴重的發(fā)病率和死亡率。感染EV71的個體常常顯示輕微的癥狀，如在手、足及背臀部的水泡和發(fā)燒。一部分EV71感染者發(fā)展成嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，包括小兒麻痹癥樣癱瘓、腦干腦炎和肺水腫，最后導致死亡。精選課件沒有特異的疫苗能夠用于阻止EV71的感染。EV71分為三個基因型(A,BandC)，進一步分為11個基因亞型(A,B1–B5,andC1–C5)。因此，理想的EV71疫苗能夠阻止大部分基因型感染。在所有研究EV71的疫苗中，病毒樣顆粒(VLP)是最有前途的疫苗。在產(chǎn)量和安全方面都優(yōu)于滅活疫苗。精選課件ChungYC,HoMS等用重組EV71病毒C2亞型病毒樣顆粒能夠在小鼠和獼猴中誘導產(chǎn)生高滴度的抗體。用EV71VLP免疫的雌鼠能夠通過被動免疫給予新生小鼠免受EV71致死性感染。證明中和抗體在免疫防御中起了重要作用。然而，抗VLP抗血清在體外如何中和EV71病毒還不清楚。精選課件現(xiàn)在的研究是：用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)EV71病毒C4亞型的重組VLP。評價VLP在小鼠體內(nèi)誘導中和抗體的能力。闡明抗VLP抗血清中和EV71的機制。精選課件材料與方法：一、細胞與病毒：實驗中用的RD與Vero細胞（KuZ,ShiJ,LiuQ,HuangZ(2012)Developmentofmurinemonoclonalantibodieswithpotentneutralizationeffectsonenterovirus71.），EV71病毒C4亞型在RD細胞中增殖。根據(jù)Reed–Muench的方法以TCID50在RD細胞上滴定其濃度。純化，滅活的病毒有hualan（中國河南）獲得。精選課件二、衣殼亞單位蛋白特異性多克隆抗體抗-VP0豚鼠多抗抗-VP3多抗用與EV71有交叉反應的重組CAV16的VP3蛋白免疫豚鼠獲得，用于檢測EV71的VP3蛋白。抗-VP1多抗用大腸桿菌表達的重組EV71的VP1蛋白免疫兔子產(chǎn)生。精選課件三、載體構(gòu)建從感染EV71病毒C4亞型的RD細胞抽提病毒RNA，隨后用脫氧核酸引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄。用cDNA作模板，擴增編碼P1與3CD基因片段。P1片段的擴增引物(forward5,–AATCCATGGGTTCGCAGGTGTCT-3,andreverse5,-GACAAGCTTTCAAAGAGTAGTGATCGC-3,),用NcoIandHindIII酶切，然后插入到質(zhì)粒pIExBac-1，成為pIExBac-P1精選課件3CD片段的擴增引物(forward5,-AATCCATGGGCCCGAGCCTTGATTTT-3,andreverse5,-GACAAGCTTTCAAAATAACTCGAGCC-3,),用NcoIandHindIII酶切,然后在同樣位點插入到質(zhì)粒pIExBac-1成為pIExBac-3CD.精選課件Figure1.Diagramsoftheconstructsusedinthisstudy.lef2,theleftsequenceforhomologousrecombination;hr5-Enh,AcNPVhr5enhancer;IE1-P,IE1immediateearlypromoter;p10-P,p10promoter;IE1-T,IE1terminator;1629,therightsequenceforhomologousrecombination.精選課件四、重組桿狀病毒的產(chǎn)生。重組載體pIExBac-P1和pIExBac-3CD，經(jīng)過轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生，選擇和重組病毒的增殖。分別產(chǎn)生相應的重組病毒，也就是IExBac-P1和IExBac-3CD。Sf9細胞用重組桿狀病毒感染，感染后72小時，收集感染的細胞和上清，用于分析。精選課件五、用ELISA和WesternBlot分析表達的蛋白桿狀病毒感染的Sf9cells用

Tris–NaClbuffer12,000rpm離心5min獲得蛋白溶解產(chǎn)物.（一）間接ELISA：包被：5ul蛋白產(chǎn)物用50ulPBS稀釋,包被96孔酶標板4℃12h;用PBST(1×PBS，0.05%Tween20)洗滌三次.封閉：用5%牛奶PBST200ul/孔37℃

1h一抗：第一抗體(豚鼠anti-VP0抗血清,兔anti-VP1抗血清或者豚鼠anti-VP3抗血清)用1%奶粉的PBST以1:1000稀釋，以50ul/孔37℃2h。精選課件二抗：標記的第二抗體(1%奶粉PBST以1:3000稀釋)以50ul/孔

37℃1h.顯色：TMB混合物以50ul/孔

5–10min;然后

50ul/1NH3PO4終止.450nm測吸光度。

（二）Westernblotting,以12%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜.用抗原特異一抗結(jié)合抗原，HRP-連接的第二抗體.用BeyoECLPluskit(Beyotime,Shanghai,China)的化學發(fā)光試劑顯示膜上的陽性標本，用

LAS-4000冷光成像分析器記錄。精選課件Figure2.CoexpressionofP1and3CDofEV71ininsectcells.Lysatesfromthebaculovirus-infectedSf9cellswereanalyzedbyELISAwith(A)anti-VP0,(B)anti-VP1,or(C)anti-VP3polyclonalantibodies,精選課件(D)byWesternblottingwiththeanti-VP0polyclonalantibody.Sf9,mock-infectedSf9celllysate;P1,lysatefromtheIExBac-P1infectedcells;3CD,lysatefromtheIExBac-3CDinfectedcells;P1+3CD,lysatefromcellsinfectedwithbothIExBac-P1andIExBac-3CD.ErrorbarsrepresentSE.精選課件六、VLPs與對照抗原的制備ToevaluateVLPassembly,theP1/3CDco-infectedcelllysatewassubjectedtosucrosegradientsedimentation桿狀病毒感染Sf9的溶解產(chǎn)物在20%的蔗糖緩沖液中以25,000rpm超速離心6h。合成的球狀物用PBS重懸，然后分層于10–50%之上39,000rpm超速離心3h。從頂?shù)降椎钠斡肧DS戶Westernblotting分析，富含VLP的層用PBS濃縮、透析，然后在20%蔗糖緩沖液中超速離心。VLPs用PBS重懸，然后用于動物免疫。用Westernblotting檢測VP0含量作為參考標準定量VLPs。未感染的Sf9溶解物如同純化VLP一樣處理，作為陰性對照抗原，用于免疫。精選課件Figure3.Sucrosegradientanalysis.Lysateswerelayeredonto10–50%sucrosegradientsforultracentrifugation.Tenfractionsweretakenfromtoptobottom.(A)SDSanalysis.ThetenfractionswereseparatedbySDS,andsubsequentlystainedwithCoomassieBluedye.M,proteinmarker.EV,purifiedwholevirionEV71standardfromHualanInc.精選課件(B)Westernblottingwithanti-VP0polyclonalantibody.(C)Westernblottingwithanti-VP1polyclonalantibody.(D)Westernblottingwithanti-VP3polyclonalantibody.精選課件七、電子顯微鏡VLP樣本用0.5%水樣乙酸雙氧鈾負染,用PhilipsCM-12S放射電子顯微鏡觀察。精選課件Figure4.ElectronmicroscopyofEV71VLPs.PartiallypurifiedVLPswerenegativelystainedwith0.5%aqueousuranylacetateandvisualizedbytransmissionelectronmicroscopy.Bar=50nm.精選課件八、VLP免疫小鼠誘導出抗EV71特異的抗體反應免疫之前,EV71VLPs與同樣制備的陰性對照(Sf9)抗原與明礬(Pierce,Rockford,IL,USA)根據(jù)廠商說明，以體積比1:1混合，混合物含有VLPs(相當于5mgVP0)或者Sf9陰性溶解產(chǎn)物.每組5只雌性Balb/c小鼠(6–8weeksold)以

0,2和5周次腹腔注射。每次免疫之前，收集血清樣本，

在第七周老鼠被處死。血清保存在-80℃?zhèn)溆?。精選課件九、抗體測定：用間接ELISA測定血清樣本中抗-EV71抗體的反應性。包被：滅活的EV71(10ng/孔)包被96-孔ELISA反應板

37℃3h.封閉：用5%奶粉PBST孵育37℃1h.加血清：用1%奶粉PBST稀釋血清樣本37℃2h。二抗：HRP連接抗小鼠IgG抗體37℃1h。顯色：顯色，450nm測量OD值。精選課件Figure5.AntibodyresponsesfollowingVLPimmunization.Groupsoffivemicewereinjectedi.p.atweeks0,2and5,withalumabsorbedantigens:EV71-VLPequivalentto5mgVP0,orthecontrollysatesimilarlypreparedfromuninfectedSf9cells.Theimmunizedmiceweresacrificedatweek7(2weeksafterthelastimmunization),andtheserum,bonemarrowandspleensampleswerecollectedandassayed.Resultsarerepresentativeoftwoindependentexperiments.(A)EV71-specificserumIgGtitersoftheSf9andtheVLPgroups.Eachsymbolrepresentsamouse,andthelineindicatesthegeometricmeanvalueofthegroup.精選課件十、斑點ELISA分析在最后免疫之后的第三周，收集三只免疫小鼠的脾臟和骨髓，做B細胞ELISPOT。分離脾細胞和骨髓細胞,濃縮、計數(shù)。96孔PVDF板(Millipore,Billerica,MA,USA)用純化滅活的EV71以100ng/孔預先包被，4℃孵育過夜。PVDF板用完全RPMI1640培養(yǎng)基37℃封閉2h。新鮮分離的脾細胞和骨髓細胞(1×105/孔)在5%CO2中37℃孵育40h。用1%FBS和0.05%Tween-20的PBS緩沖液稀釋生物素化的山羊抗-小鼠IgG，以0.1ug/孔加入到

PVDF板中，37℃2h。然后用PBS以1:1000稀釋堿性磷酸酶鏈接的鏈霉親和素37℃1h。精選課件用水沖洗6次,加NBT/BCIP酶底物100ul/孔孵育20min顯色。用水沖洗終止顯色，然后晾干。

抗體分泌細胞的斑點用CTL免疫斑點器成像計數(shù)精選課件Figure5.AntibodyresponsesfollowingVLPimmunization.(B)ELISPOTanalysisofEV71-specificantibody-secretingcellsinmousebonemarrow.Samplesfromna?¨vemicewereusedasthecontrol.Resultsoftriplicatewellsareshown.(C)ELISPOTanalysisofEV71-specificantibody-secretingcellsinmousespleens.Samplesfromna?¨vemicewereusedasthecontrol.Resultsoftriplicatewellsareshown.精選課件十一、中和能力血清樣本用含有2%FBS的DMEM培養(yǎng)基以2倍倍比稀釋。EV71稀釋到2TCID50/ul的工作濃度。中和試驗在96孔板中進行，50ul稀釋的抗血清與50ul含有100TCID50的EV71混合加入到每孔中37℃1h。然后，100ul中含有15,000RD細胞的細胞懸液

was加入到含有病毒與抗血清混合物的孔中，5%CO2中37℃培養(yǎng)。3天之后觀察并評價CPE。能夠完全保護細胞沒有出現(xiàn)CPE的最高血清稀釋度為中和作用的滴度。精選課件Figure6.VLP-immunizedseraefficientlyneutralizedEV71infectioninvitro.NeutralizationtitersoftheantiseraweredeterminedbyTCID50reductionassay.TheantiseraoftheSf9groupdidnotshowanyneutralizationat1:32(thelowestdilutiontested)andwerethereforeassignedatiterof16forGMTcomputation.Eachsymbolrepresentsamouse,andthelineindicatestheGMTofthegroup.Resultsarerepresentativeoftwoindependentexperiments精選課件十二、肽ELISA用含有VP1整個區(qū)的58個合成肽鑲嵌板做ELISA檢測抗VLP抗血清的反應性。抗血清顯著地與43#肽(FGEHKQEKDLEYGAC)反應,與以前鑒定的SP70表位(YPTFGEHKQEKDLEY)重疊。43#肽定位于VP1蛋白的GH環(huán)。Figure7.Neutralizingantibodiesintheanti-VLPserapredominantlytargetanepitopelocatedintheGHloopofVP1protein.(A)MappingofimmunodominantB-celllinearepitopeswithintheVP1protein.Thepooledanti-VLPserawereanalyzedbyindirectELISAforreactivitywithapanelof58syntheticpeptidescoveringtheentiresequencesofVP1.精選課件為了鑒定這個表位在產(chǎn)生中和抗體中的作用。43#肽以不同濃度與中和抗體混合做中和實驗，43#肽以劑量依賴的方式降低了中和抗體的中和作用，而對照HIV肽沒有干擾中和作用。證明中和抗體的目標表位在43#肽序列。(B)Neutralization-inhibitionby#43peptide.Theanti-VLPserawereincubatedwith#43peptideoranegativecontrolpeptide(fromHIV)atdifferentconcentrationsfor1hourat37℃.Thepeptide/antiserummixturesweresubjectedtoneutralizationtesting.Neutralization-inhibitionbythepeptideswasdeterminedusinganMTTmethod.Dataaremeans+DoftheOD490readingsoftriplicatewells.精選課件十四、吸附前試驗抗血清用含有2%FBS的DMEM培養(yǎng)基系列稀釋,8ul稀釋的血清與對照培養(yǎng)基加入到400ul含有9×106TCID50的EV71基因亞型C4中，37孵育1h?；旌衔锛尤氲?.5×105/孔的RD細胞和Vero細胞的12孔板中。4孵育1h。細胞用冷PBS沖洗三次。收集細胞，用抗-EV71和抗-actin的多克隆抗體做westernblotting.精選課件Figure8.InhibitoryeffectoftheantiseraonEV71attachmenttocells.Antiseraatdifferentdilutions(1:50,1:500,and1:5,000)weremixedwith400mlofEV71containing9×106TCID50,andincubatedfor1hourat37℃.Themixtureswereaddedto(A)RDor(B)Verocellsforincubationfor1hourat4℃toallowvirusattachmenttothecells.Afterincubation,thecellswerewashedwithcoldPBS