第二章均相酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第二章均相酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)EnzymeReactionDynamics目錄2.1酶催化反應(yīng)概論2.2單底物酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.3有抑制劑的酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.4復(fù)雜的酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.5酶反應(yīng)過(guò)程的影響因素2200types6kinds:氧化還原酶水解酶裂合酶異構(gòu)酶連接酶轉(zhuǎn)移酶2.1酶催化反應(yīng)概論酶的分類氧化還原酶（英文名稱：Oxidordeuctase）定義：能催化兩分子間發(fā)生氧化還原作用的酶的總稱。其中氧化酶（oxidase;oxydase）能催化物質(zhì)被氧氣所氧化的作用，脫氫酶（dehydrogenase）能催化從物質(zhì)分子脫去氫的作用。主要存在于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)移酶（英文名稱：Transferase)定義：催化將功能團(tuán)從一種底物轉(zhuǎn)移到另一種底物的酶。能夠催化除氫以外的各種化學(xué)功能團(tuán)(官能團(tuán))從一種底物轉(zhuǎn)移到另一種底物的酶類。例如轉(zhuǎn)甲基酶、轉(zhuǎn)氨酶、己糖激酶、磷酸化酶等。水解酶（英文名稱：Hydrolase）定義：催化水解反應(yīng)的酶，也可以說(shuō)它們是一類特殊的轉(zhuǎn)移酶，用水作為被轉(zhuǎn)移基團(tuán)的受體。裂合酶（英文名稱：Lyase）

定義：催化分子裂解或移去基團(tuán)的酶。反應(yīng)中發(fā)生電子重排(消除反應(yīng))，但不是水解或氧化還原反應(yīng)。可使C-C(EC4.1.-)、C-O(EC4.2.-)、C-N(EC4.3.-)及類似的鍵裂解，并在其一個(gè)產(chǎn)物中形成雙鍵或環(huán)，或在其逆反應(yīng)中加一個(gè)基團(tuán)于雙鍵上。二磷酸酮糖裂合酶(醛縮酶)，蘋(píng)果酶裂合酶(丙酮酸脫羧酶)檸檬酸裂合酶(檸檬酸合成酶)。異構(gòu)酶（英文名稱：Isomerase）

定義：催化一種同分異構(gòu)體轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪煌之悩?gòu)體的酶。根據(jù)反應(yīng)方式而分類：（1）結(jié)合于同一碳原子的基團(tuán)的立體構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)位反應(yīng)（消旋酶、差向異構(gòu)酶），如UDP葡萄糖差向酶（生成半乳糖）；（2）順?lè)串悩?gòu)；（3）分子內(nèi)的氧化還原反應(yīng)（酮糖-醛糖相互轉(zhuǎn)化等），如葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（生成磷酸果糖）；（4）分子內(nèi)基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)（變位酶），如磷酸甘油酸變位酶；（5）分子內(nèi)脫去加成反應(yīng)。葡萄糖-6-磷酸果糖-6-磷酸

定義：催化兩個(gè)分子連接成一個(gè)分子或把一個(gè)分子的首尾相連接的酶。此反應(yīng)與ATP的分解反應(yīng)相偶聯(lián)。在把兩分子相連接的同時(shí)發(fā)生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸鍵的斷裂如DNA連接酶等。催化反應(yīng)的機(jī)制如下：A+B+ATP←→A·B+ADP+Pi或A+B+ATP←→A·B+AMP+PPi連接酶（英文名稱：Ligase）降低反應(yīng)的活化能(Ea)，加快反應(yīng)速率不能改變反應(yīng)的方向和平衡關(guān)系，即不能改變反應(yīng)的平衡常數(shù)K不能改變反應(yīng)的自由能變化(ΔG)反應(yīng)前后酶本身不被消耗酶的催化共性思考：由于酶的加入，使反應(yīng)的方向改變？酶只能催化可以自發(fā)進(jìn)行的反應(yīng)，而不可能催化不能自發(fā)進(jìn)行的反應(yīng)，也不可能改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)？ArehighlyefficientReactionsarespecificCalledforco-factorparticipationReactionconditionsareverymildAreverysensitiveandeasytodenatureorde-activate（Why？How？）Highprocess

絕對(duì)專一性；相對(duì)專一性；立體專一性；官能團(tuán)專一性；序列專一性酶的催化特性反應(yīng)速率及其測(cè)定反應(yīng)速率：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變。設(shè)瞬時(shí)dt內(nèi)反應(yīng)物濃度的很小的改變?yōu)閐S，則：若用單位時(shí)間內(nèi)生成物濃度的增加來(lái)表示，則：tPtv酶催化動(dòng)力學(xué)基本概念反應(yīng)分子數(shù)反應(yīng)分子數(shù)：是在反應(yīng)中真正相互作用的分子的數(shù)目。如：A→P屬于單分子反應(yīng)根據(jù)質(zhì)量作用定律，單分子反應(yīng)的速率方程式是：又如：A＋B→C＋D屬于雙分子反應(yīng)其反應(yīng)速率方程可表示為：判斷一個(gè)反應(yīng)是單分子反應(yīng)還是雙分子反應(yīng)，必須先了解反應(yīng)機(jī)制，即了解反應(yīng)過(guò)程中各單元反應(yīng)是如何進(jìn)行的。反應(yīng)機(jī)制往往很復(fù)雜，不易弄清楚，但是反應(yīng)速率與濃度的關(guān)系可用實(shí)驗(yàn)方法來(lái)確定，從而幫助推論反應(yīng)機(jī)制。反應(yīng)級(jí)數(shù)又如某一反應(yīng)：A+B→C+D式中k為反應(yīng)速率常數(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，整個(gè)化學(xué)反應(yīng)的速率服從哪種分子反應(yīng)速率方程式，則這個(gè)反應(yīng)即為幾級(jí)反應(yīng)。例：對(duì)于某一反應(yīng)其總反應(yīng)速率能以單分子反應(yīng)的速率方程式表示，那么這個(gè)反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)。符合雙分子反應(yīng)的表達(dá)式，為二級(jí)反應(yīng)。把反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān)的反應(yīng)叫做零級(jí)反應(yīng)。

r=k反應(yīng)分子數(shù)和反應(yīng)級(jí)數(shù)對(duì)簡(jiǎn)單的基元反應(yīng)來(lái)說(shuō)是一致的，但對(duì)某些反應(yīng)來(lái)說(shuō)是不一致的。例如：Sucrose+H2O→Glucose+Frucose是雙分子反應(yīng)，但卻符合一級(jí)反應(yīng)方程式。Sucrase因?yàn)檎崽堑南∷芤褐?，水的濃度比蔗糖濃度大得多，水濃度的減少與蔗糖比較可以忽略不計(jì)。因此，反應(yīng)速率只決定于蔗糖的濃度。

r=kCs濃度因素（酶濃度，底物濃度，產(chǎn)物濃度等）外部因素（溫度，壓力，pH，溶液的介電常數(shù)，離子強(qiáng)度等）內(nèi)部因素（底物及效應(yīng)物濃度，酶的結(jié)構(gòu)）影響酶促反應(yīng)的主要因素酶與底物的作用機(jī)理LockandKeyModelInduced-FitModel象手與手套的關(guān)系；當(dāng)?shù)臀锝咏傅幕钚灾行牟⑴c之結(jié)合時(shí)，酶的構(gòu)象能發(fā)生改變，更適合于底物的結(jié)合。

Singlesubstratereaction（單底物反應(yīng)）:Twosteps:SubstrateScombineswithenzymeEtoproduceESpositionofEStoproducePandEisreleasedM-M方程的建立：2.2.1Michaelis-MentenEquation（M-M方程）2.2單底物酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)＋k+1k-1ESES＋Ek+2P

2.2單底物酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)＋k+1k-1ESES＋Ek+2P快速平衡學(xué)說(shuō)的幾點(diǎn)假設(shè)條件：酶和底物生成復(fù)合物[ES]，酶催化反應(yīng)是經(jīng)中間復(fù)合物完成的。底物濃度[S]遠(yuǎn)大于酶的濃度[E]，因此[ES]的形成不會(huì)降低底物濃度[S]，底物濃度以初始濃度計(jì)算。不考慮P+E→ES這個(gè)可逆反應(yīng)的存在。[ES]在反應(yīng)開(kāi)始后與E及S迅速達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。快速平衡假設(shè)E:free-enzymeES:enzyme-substratecomplexS:SubstrateP:Productk+1,k-1,k+2:reactionrateconstants反應(yīng)速率常數(shù)Definitionofreactionrate反應(yīng)速率:ForsubstrateSForproductPReversible可逆Irreversible不可逆根據(jù)物質(zhì)作用定律，P的生成速率表示為:Equilibriumassumption“平衡”假設(shè):總酶量保持不變Thetotalenzymeconcentrationstaysconstantduringreaction;與底物濃度cs相比，酶濃度很小，因此因生成中間酶底物復(fù)合物ES而消耗的底物S很少;theformationoftheenzyme-substratecomplexdoesnotsignificantlydepletethesubstrate(1)(2)＋k+1k-1ESES＋Ek+2PFastSlow由ES向產(chǎn)物P分解轉(zhuǎn)化的速度明顯小于ES回復(fù)為E+S的分解速率,因此復(fù)合物ES的可逆反應(yīng)處于準(zhǔn)平衡態(tài).Theenzyme-substratecomplexformationrateismuchfasterthanitsreleasingtoproduct.Sothefirststepisinequilibrium.FastSlowES在反應(yīng)開(kāi)始后與E及S迅速達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。(3)＋k+1k-1ESES＋Ek+2P對(duì)于酶復(fù)合物ES的解離平衡過(guò)程來(lái)說(shuō)，由公式(3)，其解離常數(shù)可以表示為,ES

E+Sk-1k+1反應(yīng)體系中酶量守恒：由公式(3)得：代入公式(1),變換后得：即,代入公式得到(1)(4)推導(dǎo)過(guò)程:代入式(4)得：式中：rmax:最大反應(yīng)速率如果酶的量發(fā)生改變，最大反應(yīng)速率相應(yīng)改變。KS:解離常數(shù)，飽和常數(shù)

低KS值意味著酶與底物結(jié)合力很強(qiáng)，

(看看KS的公式就知道了，why？)。當(dāng)反應(yīng)初始時(shí)刻，底物CS>>CE,幾乎所有的酶都與底物結(jié)合成復(fù)合物ES，因此CE0≈CES,反應(yīng)速率最大，此時(shí)產(chǎn)物的最大合成速率為：M-MEquation(5)Enzymereactionkineticparameters酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù):KS：Michaelisconstant.

rmax：MaximumrateMichaelisconstantequalsthesubstrateconcentrationathalfofmaximumrate當(dāng)反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率的一半時(shí)，米氏常數(shù)等于底物濃度SS當(dāng)酶底物復(fù)合物ES生成產(chǎn)物的速率與其分解成酶和底物的速率相差不大時(shí)，上述“平衡”假設(shè)不適應(yīng)。Why？Quasi-steadyassumption擬穩(wěn)態(tài)假設(shè):K+2isverybigRelativelyslowFastES的生成速率與其解離速率相等，其濃度不隨時(shí)間而變化。擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)擬穩(wěn)態(tài)的幾點(diǎn)假設(shè)條件：酶和底物生成復(fù)合物[ES]，酶催化反應(yīng)是經(jīng)中間復(fù)合物完成的。底物濃度[S]遠(yuǎn)大于酶的濃度[E]，因此[ES]的形成不會(huì)降低底物濃度[S]，底物濃度以初始濃度計(jì)算。在反應(yīng)的初始階段，產(chǎn)物濃度很低，P+E→ES這個(gè)可逆反應(yīng)的速率極小，可以忽略不計(jì)。[ES]的生成速率與其解離速率相等，其濃度不隨時(shí)間而變化。Experimentaldatademonstratedtheconcentrationprofiles.當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中[ES]的生成速率與分解速率相等時(shí)，[ES]濃度保持不變的狀態(tài)稱為穩(wěn)態(tài)。由于反應(yīng)體系中底物濃度要比酶的濃度高的多，酶底物復(fù)合物ES分解生成產(chǎn)物時(shí)，釋放的酶E又會(huì)迅速與底物S結(jié)合，從而維持反應(yīng)體系中酶底物復(fù)合物ES的濃度維持不變，即不隨時(shí)間變化而變化Quasi-steadyassumption擬穩(wěn)態(tài)假設(shè):（6）Ifk+2<<k+1?（7）Keypoint!ComparisonwithM-constant:S平衡假設(shè)與穩(wěn)態(tài)假設(shè)快速平衡學(xué)說(shuō)與穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)在動(dòng)力學(xué)方程形式上是一致的，但Km和KS表示的意義是不同的。當(dāng)k+2<<k-1時(shí)，Km=KS這意味著生成產(chǎn)物的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于[ES]復(fù)合物解離的速率。這對(duì)于許多酶反應(yīng)也是正確的。MixedorderwithrespecttoS當(dāng)Cs<<Km時(shí)，曲線近似為直線，反應(yīng)速率與底物濃度近似成正比的關(guān)系，可看作為一級(jí)反應(yīng)。當(dāng)Cs>>Km時(shí)，曲線近似為一水平線，底物濃度繼續(xù)增加時(shí)，反應(yīng)速率變化不大，可看作為零級(jí)反應(yīng)。當(dāng)在兩者之間，則符合M-M方程表達(dá)式。雙曲線型。米氏常數(shù)Km的意義Km值代表反應(yīng)速率達(dá)到rmax/2時(shí)的底物濃度。Km是酶的一個(gè)特性常數(shù)，Km的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)。但底物種類、反應(yīng)溫度、pH和離子強(qiáng)度等因素會(huì)影響Km值。因此可以用Km值來(lái)鑒別酶。Km值可以判斷酶的專一性和天然底物。當(dāng)k+2<<k-1時(shí)，Km＝KS

，那么Km可以作為酶和底物結(jié)合緊密程度的一個(gè)度量，表示酶和底物結(jié)合的親合力大小。若已知Km值，可以計(jì)算出某一底物濃度時(shí)，其反應(yīng)速率相當(dāng)于rmax的百分率。例如:當(dāng)CS=3Km時(shí)，代入米氏方程后可求得r=0.75rmaxKm值可以幫助推斷某一代謝反應(yīng)的方向和途徑。催化可逆反應(yīng)的酶，對(duì)正逆兩向底物的Km值往往是不同的，例如谷氨酸脫氫酶，NAD+的Km值為2.5×10-5mol/L，而NADH為1.8×10-5mol/L。測(cè)定這些Km值的差別及正逆兩向底物的濃度，可以大致推測(cè)該酶催化正逆兩向反應(yīng)的效率。問(wèn)題:產(chǎn)物的積累使逆反應(yīng)的影響不可忽略產(chǎn)物可能會(huì)抑制或激活酶的活力隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶的活力可能會(huì)失活反應(yīng)體系中的一些雜質(zhì)可能會(huì)影響到酶的活性…….2.為什么說(shuō)低Km值意味著酶與底物的結(jié)合力強(qiáng)？1.為什么只有初始反應(yīng)速率可以使用？考慮一下Km的定義：?jiǎn)栴}:3.為什么k+2往往會(huì)小于k-1？因?yàn)樯蓮?fù)合物ES的結(jié)合力是很弱的，因而其解離速率很快；而復(fù)合物生成產(chǎn)物則包括化學(xué)鍵的生成和斷開(kāi)，其速率當(dāng)然要慢得多。因此在一般情況下，ES→E+P這一步是整個(gè)過(guò)程的限速步驟。k+2表示當(dāng)酶被底物飽和時(shí)，每秒種每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，這個(gè)常數(shù)又稱轉(zhuǎn)換數(shù)（kcat），kcat越大，表示酶的催化效率越高。k+2=kcat=rmax/CE0kcat/Km:作為酶催化效率的參數(shù)是很恰當(dāng)?shù)摹Ｋ纳舷奘莐+1,即生成ES復(fù)合物的速率。換言之，酶的催化效率不能超過(guò)E和S形成ES的擴(kuò)散控制的結(jié)合速率。擴(kuò)散限制了k+1的數(shù)值，在水中擴(kuò)散的速率常數(shù)大約為108-109mol-1Ls-1。(9)AnalysisofM-Mequation--Threestages米氏方程三個(gè)不同動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)的區(qū)域:Cs<<Km:linearly1storderreaction一級(jí)反應(yīng):

rs=rmaxCs/Km=KCs

integrated:2.2.2動(dòng)力學(xué)特征與參數(shù)求取:如何解釋？

(10)B)Cs>>Km:Zeroorderreaction零級(jí)反應(yīng):

rs=rmax

Integrated:如何解釋？

分批酶反應(yīng)體系中Cs隨時(shí)間的變化過(guò)程可以用表示為：Integrated:C)Middlestate:符合M-M方程

(11)由公式：得，如何解釋？

結(jié)合t=0，CS=CS0的初值積分，Twobasicparameters:Km,rmaxThroughkineticexperimentstodeterminethetwoparameters.M-Mequationisnon-linearequation,Howtodothedataprocess?Determinationofkineticparameters參數(shù)求取的方法:Linearization線性法:Integration積分法:L-Bplot(12)1）Lineweaver-Burekmethod:---reciprocallinearization(L-B法)s取倒數(shù)得：1.Linearization線性法:(13)2）Hanes-Woolfmethod（H-W法）:H-Wplot乘以CS得：(14)3）Eadie-Hofsteemethod（E-H法）:E-Hplots重排得：上述方法共同特點(diǎn)：要從動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中獲取不同CS值得rS值，而rS不能從實(shí)驗(yàn)直接獲得；實(shí)驗(yàn)中能直接得到的是不同時(shí)間t時(shí)的底物濃度CS；微分法作圖；2.Integrationmethod積分法:Integrated:與對(duì)應(yīng)作圖，得到一直線，or:(15)(15)例2-1：某酶催化反應(yīng)，其Km=0.01mol/L,現(xiàn)測(cè)得該反應(yīng)進(jìn)行到10min時(shí)，底物濃度為3.4×10-5,已知CS0=3.4×10-4

mol/L.假定該反應(yīng)可用M-M方程表示。試求：

(1)最大反應(yīng)速率是多少?

(2)反應(yīng)20min后，底物濃度為多少？解：已知米氏方程及題中條件知CS0<<Km則米氏方程可表示為10min時(shí),CS=3.4×10-5,代入上式可得：Vmax=(0.01×ln10)/10=0.0023molL-1min-1當(dāng)t=20min,lnCS=lnCS0-Vmaxt/Km

=ln(3.4X10-4)-0.0023X20/0.01

CS20min=3.42X10-6mol/L2.2.3底物抑制動(dòng)力學(xué)Question:Isthereanyphenomenawhensubstrateinhibition?底物抑制現(xiàn)象？EES+SXPSESS定義：在底物濃度增加時(shí)，反應(yīng)速率不增反降，這種由底物濃度增大而引起反應(yīng)速率下降的作用稱之為“底物抑制作用”。SEShasnotactivity三元復(fù)合物EnzymeisconsumedSubstrateinhibitionmechanism（底物抑制機(jī)理）Induction：Keypoints：平衡假設(shè)ExpressionofcSESKSI：底物抑制的解離常數(shù)Fromequation（1），（2），（3）,thefollowingexpressionscanbeobtained:快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)學(xué)方程：式中:Namely,thenorNamely,thenorDiscussions：LowsubstrateconcentrationTheoriginMichaelis-Mentenequationobtained,thusnoinhibitionobserved.HighsubstrateconcentrationTheinhibitioneffectisdominant.Howtodeterminetheo