DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染配方及步驟

DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染配方及步驟公司內(nèi)部編號(hào)：(GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染配方及步驟最近需要做DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,需要用銀染顯示條帶,但是找不到具體的配方和步驟,不知和蛋白PAGE電泳銀染有什么差別,哪位師兄師姐有配方可否發(fā)一份,十分感謝!一、電泳試劑：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)2、10％過(guò)硫酸胺3、TEMED4、5xTBEl二、銀染試劑三、配膠(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1)8ml，5xTBE8ml，定容至40ml，加10％過(guò)硫酸胺200ul；TEMED20ul。室溫凝固時(shí)間>1小時(shí)。3、0.2%AgNO3100ml＋37％甲醛50ul，混勻，避光染色30~50m。5、1.5%NaOH100ml，加37％甲醛0.5ml，混勻，顯色3~10m。6、水洗若干次，終止顯色。在終止顯色過(guò)程中，將依慣性繼續(xù)顯色，所以不等顯色到位即可進(jìn)行終顯色到位后立即拍攝，水浸泡過(guò)夜將使背景加深轉(zhuǎn)貼?。?！聚丙烯酰胺凝膠電泳是分子生物學(xué)常用的一種技術(shù)。我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行基因組甲基化的篩選，取得了一定結(jié)果。因?yàn)槿蚪M的篩選需要很高的靈敏度，背景干擾降到最低，因此在對(duì)凝膠進(jìn)行染色時(shí)，往往采用同位素法或銀染法，而且配制的膠往往很大，我們配制的是大的復(fù)雜性，許多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展有一定困難。銀染法相對(duì)簡(jiǎn)便易行，便于一般的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。需要指出的是，應(yīng)用與篩選基因組的銀染往往采用測(cè)序膠的染色方法，這樣才能保證靈敏性，我們?cè)陂L(zhǎng)期的工作中積累了一些銀染的經(jīng)驗(yàn)，與大家分享。下面是網(wǎng)上的一個(gè)銀染方法，我們使用后覺(jué)得效果不錯(cuò)，然后以此為基礎(chǔ)，介紹一下我們的經(jīng)驗(yàn)測(cè)序凝膠的銀染染色過(guò)程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個(gè)盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質(zhì)量的水洗滌盤子。1.電泳完畢后用一個(gè)塑料片子小心地分開(kāi)兩板，凝膠應(yīng)該牢固地附著在短玻璃板上。2.固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒(méi),充分振蕩20分鐘或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過(guò)夜(不振蕩)。保留固定/停止溶液，用于終止顯影反應(yīng)。轉(zhuǎn)20秒，使水流盡。色：把凝膠移至染色溶液充分搖動(dòng)30分鐘。(1).在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成顯影液的配制。(2).從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注重，把凝膠從超純水轉(zhuǎn)移到顯影溶液的總時(shí)間不能長(zhǎng)于5-10秒。浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則導(dǎo)致信號(hào)微弱或喪失信號(hào)。若浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可重復(fù)第五步用染色液浸泡。(3).馬上將凝膠轉(zhuǎn)移至1升(總量的一半)預(yù)冷的顯影液充分振蕩直至模板帶開(kāi)始顯現(xiàn)或開(kāi)始出現(xiàn)第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影鐘,或直至所有條帶出現(xiàn)。6.固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應(yīng),固定凝膠。7.在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鐘，注重在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。8.將凝膠置于室溫干燥或用抽氣加熱法干燥。在可見(jiàn)光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄,則可用EDF膠。(1)固定液：網(wǎng)上有好幾種固定液的配制方法，我們采用的是10％的冰乙酸，用蒸餾水稀釋即可，簡(jiǎn)便易行?？商崆芭渲?，室溫放置。(2)染色液：我們用的是0.1％的硝酸銀溶液，加入3ml甲醛。硝酸銀要現(xiàn)用現(xiàn)配，時(shí)間長(zhǎng)了硝酸銀會(huì)分解，一般在固定的時(shí)候配制，要有一段時(shí)間讓硝酸銀充分溶解。(3)顯影液：用10％碳酸鈉，北化的質(zhì)量就不錯(cuò)，完全不用買進(jìn)口的，充分預(yù)冷，顯色時(shí)很難控制顯色時(shí)間，不是染過(guò)了導(dǎo)致背景很高，就是染的很淺。因此在固定前就要把顯影液配好。(4)在2L顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成一般都是這樣做的。甲醛將銀離子還原為金屬銀，硫代硫酸鈉防止自由銀離子還原為金屬銀，否則會(huì)增加背景。甲醛和硫代硫酸鈉溶液的量是變化的，根據(jù)凝膠染色的效果決定。當(dāng)時(shí)我是把甲醛調(diào)整為2.7ml，硫代硫酸鈉改為420μl，兩者作用不一樣，所以調(diào)整的時(shí)候一個(gè)多，一個(gè)少，而且要微調(diào)。具體什么方向調(diào)整忘記了，需要摸索最合適的條件。(5)也是比較重要的，即一定要分兩次顯色，第一次顯色出現(xiàn)條帶后馬上轉(zhuǎn)移至剩下的顯影液中。顯色時(shí)間第一次大概是5分鐘左右，操作中一定要在邊上看著。顯色后馬上放入終止液(10％的冰乙酸)中，兩分鐘后放入純水中即可，兩分中后取出即可。(6)對(duì)我來(lái)說(shuō)教訓(xùn)最為慘痛的，即顯色時(shí)間的控制。第二次顯色時(shí)不要等所有條帶都出來(lái)后再終止，因?yàn)轱@色有一個(gè)延續(xù)效應(yīng)。當(dāng)時(shí)我染色我的經(jīng)驗(yàn)是：當(dāng)染色離自己期望的效果還差那么兩點(diǎn)時(shí)馬上終止，具體復(fù)丙烯酰胺凝膠電泳，我看到文獻(xiàn)