生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分測(cè)定

大綱要求了解體內(nèi)中藥制劑分析的性質(zhì)、意義和任務(wù)熟悉中藥制劑在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化、生物樣品內(nèi)藥物分析方法掌握體內(nèi)中藥制劑的制備方法及注意事項(xiàng)第一頁(yè)，共84頁(yè)。第一節(jié)概述一、體內(nèi)中藥制劑分析的性質(zhì)二、體內(nèi)中藥制劑分析的目的意義三、體內(nèi)中藥制劑分析的任務(wù)四、體內(nèi)中藥制劑分析的對(duì)象五、體內(nèi)中藥中藥制劑分析的特點(diǎn)第二頁(yè)，共84頁(yè)。第一節(jié)概述一、體內(nèi)中藥制劑分析的性質(zhì)體內(nèi)中藥制劑分析又稱體液藥物分析、生物藥物分析，是隨著臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)的發(fā)展和需要而建立起來(lái)的一門新興學(xué)科。第三頁(yè)，共84頁(yè)。概述二、體內(nèi)中藥制劑分析的目的意義

研究及了解中藥制劑在生物樣品內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量變化，獲得藥物代謝動(dòng)力學(xué)的各種參數(shù)、藥物在生物樣品內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化、代謝的方式和途徑等信息，從而為藥品生產(chǎn)、臨床醫(yī)療、實(shí)驗(yàn)研究等方面對(duì)所研究藥物作出估計(jì)與評(píng)價(jià)。第四頁(yè)，共84頁(yè)。第一節(jié)概述三、體內(nèi)中藥制劑分析的主要任務(wù)1.分析方法學(xué)的研究2.生物體內(nèi)藥物濃度檢測(cè)中的應(yīng)用3.藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用4.生物利用度的評(píng)價(jià)第五頁(yè)，共84頁(yè)。第一節(jié)概述四、體內(nèi)中藥制劑分析的對(duì)象受試者：大鼠、兔、狗、猴、人分析對(duì)象：體液、器官、組織、排泄物等分析的目標(biāo)：母體藥物代謝產(chǎn)物第六頁(yè)，共84頁(yè)。第一節(jié)概述五、體內(nèi)中藥制劑分析的特點(diǎn)（掌握）1.干擾雜質(zhì)多：內(nèi)源性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、脂肪酸、色素、酶等；代謝物、共存藥物等2.樣品量少：生物體采樣量受限3.藥物濃度低第七頁(yè)，共84頁(yè)。第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化一、藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)二、藥物代謝研究的意義第八頁(yè)，共84頁(yè)。第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化一、存在狀態(tài)游離藥物結(jié)合藥物

蛋白質(zhì)結(jié)合不能透過(guò)細(xì)胞膜可逆第九頁(yè)，共84頁(yè)。第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化二、藥物代謝研究的意義了解藥物進(jìn)入生物體后的狀態(tài)、與生物系統(tǒng)的相互作用，保證臨床用藥安全、有效研究藥物的代謝途徑、酶催化機(jī)制、結(jié)構(gòu)與藥理作用的關(guān)系，對(duì)避免藥物的毒性及尋找新藥具一定意義研究藥物相互作用、毒性作用機(jī)制，使臨床用藥更加安全、合理第十頁(yè)，共84頁(yè)。第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化1、藥物代謝的器官肝臟肝微粒體中存在的藥物代謝酶另外：腎、脾、肺、腸粘膜、胎盤等組織第十一頁(yè)，共84頁(yè)。第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化2、藥物代謝的過(guò)程第一階段：藥物在以細(xì)胞色素P450為核心的混合功能氧化酶等催化下發(fā)生氧化、還原、水解等反應(yīng)，增加極性基團(tuán)、水溶性增強(qiáng)，活性改變第二階段：藥物與代謝物在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等催化下，與葡萄糖醛酸、硫酸鹽等結(jié)合，極性進(jìn)一步增大，便于從尿中排泄第十二頁(yè)，共84頁(yè)。第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化舉例川芎嗪：主要是氧化代謝第十三頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備一、選擇體液或組織供體內(nèi)藥物分析的一般原則二、常用生物樣品的種類、特點(diǎn)與采集三、樣本的代表性四、樣品的儲(chǔ)存五、樣品的預(yù)處理第十四頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備一、選擇體液或組織供體內(nèi)藥物分析的一般原則：1、能夠反映出濃度與藥效之間的關(guān)系2、易于獲得3、便于處理、適合分析4、根據(jù)不同檢測(cè)目的與要求進(jìn)行選取第十五頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備二、常用生物樣品的種類、特點(diǎn)與采集按照生物樣品的性質(zhì)，生物樣品可分為：均勻樣品：血液、尿液、唾液、膽汁、腦脊液、淋巴液等非均勻樣品：心、肝、脾、肺、腦等器官組織第十六頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備二、常用生物樣品的種類、特點(diǎn)與采集（一）血樣（二）尿液（三）唾液（四）膽汁（五）臟器組織第十七頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（一）血樣1、采血方式及評(píng)價(jià)多用靜脈采血注意：將注射器內(nèi)取好的血液轉(zhuǎn)入試管或其他容器時(shí)，應(yīng)注意勿用力壓出，而應(yīng)取下針頭后輕推，以免血球破裂使血漿（或血清）帶紅色。第十八頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備2、全血、血漿和血清樣品的制備血液自然凝結(jié)離心上層：血清（40％）下層：血細(xì)胞加抗凝劑離心上層：血漿（50％）下層：血細(xì)胞全血第十九頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備2.1抗凝劑的選擇：肝素最常用，一般不會(huì)干擾藥物分析及導(dǎo)致藥物發(fā)生化學(xué)變化枸櫞酸鹽、乙二胺四乙酸（EDTA）：能與血中Ca2+結(jié)合，可能引起被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)變化或干擾藥物的測(cè)定肝素是一種含硫酸的粘多糖，常用其鈉鹽、鉀鹽，能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，一般1ml血液需要用肝素0.1~0.2mg，血液放入有抗凝劑的試管后輕輕旋搖容器，但勿太猛烈。第二十頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備3.全血、血漿和血清樣品的應(yīng)用3.1血清和血漿可任意選用，測(cè)定方法可通用，但血漿量多應(yīng)用方便，若血漿內(nèi)抗凝劑對(duì)藥物分析有影響，則應(yīng)使用血清樣品血藥濃度均指血漿或血清中的藥物總濃度（游離的和與血漿蛋白結(jié)合的總濃度）（微透析技術(shù)除外）第二十一頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備3.2全血：不能很好反映藥物的藥理作用強(qiáng)度，不能作為作用部位藥濃的可靠指標(biāo)（血細(xì)胞中的藥物暫時(shí)僅作為“儲(chǔ)庫(kù)”，失去藥理作用）第二十二頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備血樣的特點(diǎn)：缺點(diǎn)：損傷性采樣方式、樣品量受限、抽血比較麻煩優(yōu)點(diǎn)：可用于藥物動(dòng)力學(xué)、生物利用度、臨床治療藥物監(jiān)測(cè)第二十三頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（二）唾液

可用作藥物濃度檢測(cè)及藥代動(dòng)力學(xué)研究唾液中藥物濃度通常與血漿濃度相關(guān)，比血漿藥物濃度低收集方法：漱口后15min收集不同唾液腺分泌不同的唾液，成分不盡相同個(gè)體差異大第二十四頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（三）尿液用于藥物劑量回收、藥物腎清除率及代謝類型等研究體內(nèi)中藥清除主要是通過(guò)尿液排出，藥物以原型、代謝物、綴合物形式排出收集方法：規(guī)定的時(shí)間內(nèi)采集尿液第二十五頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1.特點(diǎn)1.1尿中藥物濃度改變不直接反映血藥濃度1.2尿液藥物濃度較高，收集量大，但濃度變化較大，要測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)尿中藥物總量，需要記錄排出的尿液體積及尿藥濃度1.3短時(shí)間內(nèi)不能多次取樣，排尿時(shí)間較難掌握及不易采集完全等缺點(diǎn)第二十六頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（四）膽汁闡明藥物的膽汁排泄率及藥物的體內(nèi)動(dòng)態(tài)特性方法：膽汁引流規(guī)定時(shí)間內(nèi)收集膽汁計(jì)算累積排泄量第二十七頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（五）臟器組織用于研究成分在各器官、組織的分布、積蓄或代謝研究臟器組織可與成分形成強(qiáng)烈結(jié)合分離分析前，需預(yù)先制成1：5或1：10勻漿，提高溶劑抽提率，降低組織空白值，避免乳化第二十八頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備三、樣本的代表性1、取樣條件標(biāo)準(zhǔn)化（攝取標(biāo)準(zhǔn)膳食、控制飲水量等）2、取樣時(shí)間及其間隔一般在吸收相至少需要2~3個(gè)采樣點(diǎn)，對(duì)于吸收快的血管外給藥的藥物，應(yīng)盡量避免第一個(gè)點(diǎn)是峰濃度（Cmax）；在Cmax附近至少需要3個(gè)采樣點(diǎn)；消除相需要4~6個(gè)采樣點(diǎn)。整個(gè)采樣時(shí)間至少應(yīng)持續(xù)到3~5個(gè)半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為Cmax的1/10~1/20第二十九頁(yè)，共84頁(yè)。冷藏或冷凍1、血漿和血清：采血后及時(shí)分離（2h），短期4℃，長(zhǎng)期-20℃2、尿樣：應(yīng)立即測(cè)定，否則需加防腐劑置冰箱保存3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取樣時(shí)測(cè)定pH值4、生物樣品總的原則：臨時(shí)解凍，解凍的樣品一次測(cè)完，不能反復(fù)冷凍→解凍→冷凍(FTC)；樣品應(yīng)以小體積分裝存放。第三節(jié)生物樣品的制備第三十頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備五、樣品的預(yù)處理（掌握）目的1.藥物從綴合物中釋放，測(cè)定總濃度2.純化、富集藥物3.適應(yīng)和滿足測(cè)定方法要求的靈敏度4.防止對(duì)分析儀器的污染和劣化第三十一頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備五、樣品的預(yù)處理（掌握）（一）提取方法的選擇依據(jù)（二）藥物的提取（三）藥物的分離與凈化（四）待測(cè)組分的富集（五）衍生物處理第三十二頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（一）提取方法的選擇依據(jù)藥物的理化性質(zhì)藥物的濃度范圍藥物測(cè)定的目的生物樣品的類型樣品處理與分析技術(shù)的關(guān)系第三十三頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（二）藥物的提取1、蛋白質(zhì)處理：干擾分析、污染測(cè)定條件2、綴合物水解：測(cè)定母體藥物3、水溶性強(qiáng)的藥物：冷凍干燥，凍干后進(jìn)行液－固萃取第三十四頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1、蛋白質(zhì)處理加入與水相混溶的有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化沉淀劑：乙腈（1.5倍）、甲醇（2倍）乙醇、丙酮：很難揮干濃集超速離心（10000r/min）去除90％蛋白加保護(hù)柱第三十五頁(yè)，共84頁(yè)。第三十六頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1、蛋白質(zhì)處理加入中性鹽蛋白質(zhì)脫水沉淀沉淀劑：硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、枸櫞酸鹽1：290％去除超速離心（10000r/min）第三十七頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1、蛋白質(zhì)處理加入強(qiáng)酸常用溶劑（與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽沉淀）：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－鎢酸混合液體積比：1：0.690％去除方法：超速離心（10000r/min）第三十八頁(yè)，共84頁(yè)。第三十九頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1、蛋白質(zhì)處理沸水浴超濾、透析法（游離藥物濃度）第四十頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備2、綴合物水解含義：中藥制劑待測(cè)成分或其代謝物與體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物特點(diǎn)：綴合物極性較母體藥物大，親水性強(qiáng)，不易被有機(jī)溶劑提取，需水解處理第四十一頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備2、綴合物水解水解方法：酸水解，酶水解（葡萄糖醛酸苷酶，芳基硫酸酯酶），溶解劑趨勢(shì)：直接測(cè)定綴合物的量，了解藥物代謝情況第四十二頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備3、冷凍干燥特點(diǎn)：適合于一次不能完成分析的大批量生物樣品、水溶性樣品、揮發(fā)性樣品和對(duì)熱不穩(wěn)定的樣品方法：干冰－丙酮浴、用液氮、冷凍干燥儀第四十三頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（三）藥物的分離和凈化1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)2、液－固萃取(liquid-solidextraction,LSE)第四十四頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE)大多數(shù)藥物都是脂溶性的，內(nèi)源性物質(zhì)基本上都是水溶性的，當(dāng)用有機(jī)溶劑萃取時(shí)，藥物被萃取出來(lái)而內(nèi)源性物質(zhì)被除去，因此采用有機(jī)溶劑萃取法能夠達(dá)到純化的目的第四十五頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)關(guān)鍵要考慮三個(gè)方面的因素：（1）有機(jī)溶劑的特性（2）有機(jī)溶劑相和水相的體積（3）水相的pH值第四十六頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE)萃取率應(yīng)不低于50％影響提取率的因素：水相的PH值提取溶劑：低沸點(diǎn)、低毒性（乙酸乙酯）、無(wú)水Na2SO4脫水離子強(qiáng)度：加入氯化鈉，有利于提取，減少乳化第四十七頁(yè)，共84頁(yè)。1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE血漿或其他生物樣品加入萃取溶劑分取有機(jī)層必要時(shí)調(diào)pH值減壓氮?dú)獯蹈闪鲃?dòng)相溶解后進(jìn)樣分析第四十八頁(yè)，共84頁(yè)。1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE消除LLE中產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象：1、提取前在水相中加入適量的固體食鹽2、經(jīng)適當(dāng)轉(zhuǎn)速離心消除已產(chǎn)生的輕微乳化3、置于冰箱中快速凍凝破壞乳化層，再融化后離心來(lái)消除已產(chǎn)生的嚴(yán)重乳化現(xiàn)象第四十九頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE)離子對(duì)提取法原理：一些酸性或堿性較強(qiáng)的有機(jī)藥物在體液中呈離解狀態(tài)，成為親水性極強(qiáng)的帶電荷離子，控制PH值也不能抑制其解離，不能用有機(jī)溶劑將其自體液中提取出來(lái)。加入離子對(duì)試劑，使其成為具有一定脂溶性的離子對(duì)化合物，用有機(jī)溶劑將其自水相中萃取分離。第五十頁(yè)，共84頁(yè)。1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE)

常用的離子對(duì)試劑及提取溶劑堿性藥物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等酸性藥物：四丁基銨、四乙基銨、四辛基銨提取溶劑：氯仿、二氯甲烷第五十一頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備2、液－固萃?。╨iquid-solidextraction,LSE)原理：利用固體材料作為固定相，當(dāng)含多組分的生物樣品溶液通過(guò)時(shí)，固定相對(duì)各組份具有不同的親和性，一些組分受到“分配”或“吸附”作用而滯留在固定相上，當(dāng)使用流動(dòng)相沖洗時(shí)，由于流動(dòng)相對(duì)組分的親和性更強(qiáng)，隨按組分洗脫的難易，將其依次攜帶出柱，使之達(dá)到分離。第五十二頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備LSE與LLE相比其優(yōu)點(diǎn)固相與體液樣品接觸時(shí)很少引入外源性雜質(zhì)不會(huì)形成乳化現(xiàn)象萃取效率高，可減少生物樣品的用量萃取操作可在室溫進(jìn)行，適于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物第五十三頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備

LSE與LLE相比其缺點(diǎn)不同的藥物應(yīng)選擇合適的固定相，并且應(yīng)試驗(yàn)洗脫時(shí)間和篩選合適的洗脫系統(tǒng)。血漿樣品反復(fù)凍凝和解凍后，會(huì)產(chǎn)生絮狀蛋白沉淀，阻塞固相提取柱，需先離心除去后再上柱不同批號(hào)的固相之間對(duì)藥物的萃取回收率有差異第五十四頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（四）待測(cè)組分的富集方法：揮去萃取溶劑法1.直接通入氣流吹干氣體：壓縮空氣，氮?dú)猓ㄒ籽趸谋粶y(cè)組分）注意：1.熱穩(wěn)定性成分，可置于一定溫度的水浴中加快揮發(fā)，溶劑吹干后立即停止通氣2.避免某些組分隨溶劑一起揮發(fā)損失，可加入沸點(diǎn)稍高的溶劑（如己醇）第五十五頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備2.減壓揮去溶劑方法：置玻璃真空干燥器內(nèi)緩緩抽氣適用：易隨氣流揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物注意：注意控制減壓程度和速度第五十六頁(yè)，共84頁(yè)。第三節(jié)生物樣品的制備（五）衍生物處理注意：注意優(yōu)化衍生化條件第五十七頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法一、分析方法的設(shè)定依據(jù)二、方法建立的一般步驟三、方法的評(píng)價(jià)四、常用的定量分析方法第五十八頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法一、分析方法的設(shè)定依據(jù)1.文獻(xiàn)總結(jié)2.了解待測(cè)藥物的特性與生物樣品內(nèi)狀況3.明確測(cè)定目的與要求藥動(dòng)學(xué)參數(shù)測(cè)定：不強(qiáng)調(diào)簡(jiǎn)便、快速臨床藥物濃度檢測(cè)：要求方法簡(jiǎn)便、快速第五十九頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法二、方法建立的一般步驟1.以純品進(jìn)行測(cè)定：Rt2.空白樣品測(cè)定:內(nèi)源性干擾3.空白樣品中添加對(duì)照品后測(cè)定4.空白樣品中添加內(nèi)標(biāo)物后測(cè)定5.生物樣品添加內(nèi)標(biāo)物后測(cè)定第六十頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法三、方法的評(píng)價(jià)（一）專屬性（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍（三）準(zhǔn)確度（四）精密度（五）定量下限（六）樣品穩(wěn)定性第六十一頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（一）專屬性1、目的：證明所測(cè)定的物質(zhì)是預(yù)期的分析物，內(nèi)源性物質(zhì)和其他代謝物不得干擾樣品的測(cè)定。2、方法：色譜法至少要考察6個(gè)不同個(gè)體空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖。第六十二頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍方法：將藥物對(duì)照品（實(shí)為對(duì)照品溶液）加入與供測(cè)樣品相同的空白生物基質(zhì)中混勻，配成已知藥濃的標(biāo)準(zhǔn)品樣品，然后按照樣品預(yù)處理的方法進(jìn)行處理后測(cè)定，將響應(yīng)值與藥濃建立標(biāo)準(zhǔn)曲線使標(biāo)準(zhǔn)樣品與供測(cè)樣品均處于相同的生物基質(zhì)環(huán)境中，按相同方法平行處理和測(cè)定，將所有樣品中的藥物及標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品中的藥物均按相同比例表現(xiàn)為響應(yīng)值第六十三頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍注意：1.標(biāo)準(zhǔn)曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內(nèi)濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度。2.用至少5個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)濃度，不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。3.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)隨行空白生物樣品，但計(jì)算時(shí)不包括該點(diǎn)。第六十四頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（三）準(zhǔn)確度方法：將已知量的藥物純品加到空白樣品中經(jīng)過(guò)一系列的處理、測(cè)定，所得藥物量與加入量之比值得百分率即為回收率注意：每次測(cè)定所得回收率要保持恒定、重現(xiàn)性好分類：絕對(duì)回收率和方法回收率第六十五頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法1.絕對(duì)回收率：又稱萃取回收率、提取回收率,反映一個(gè)方法的萃取效率高、中、低三種濃度吹干吹干甲乙+空白體液+混勻+有機(jī)溶劑萃取取萃取液，吹干+有機(jī)溶劑溶解+有機(jī)溶劑溶解分析分析結(jié)果比較第六十六頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法1.絕對(duì)回收率：高、中、低濃度的選擇：低濃度選擇在定量下限附近，其濃度在定量下限的3倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限；中間選一個(gè)濃度。每一濃度每批至少測(cè)定5個(gè)樣品。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差一般應(yīng)小于15%，在定量下限附近相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于20%。絕對(duì)回收率數(shù)據(jù)要求：≥50％第六十七頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法2.方法回收率：又稱為相對(duì)回收率加樣回收實(shí)驗(yàn)法R＝(M-P)/A×100％85％~115%(樣品藥濃≥200μg/L)80％~120％（樣品藥濃＜200μg/L）考察加入藥物量在真實(shí)樣品中的回收率，因此加入藥物量應(yīng)有高、中、低三種，而含藥物的真實(shí)樣品則可僅使用一種濃度，應(yīng)將該濃度樣品事先測(cè)定3~5次后取均值，作為原藥量p，然后加入高、中、低不同量的藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液。第六十八頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（三）準(zhǔn)確度絕對(duì)回收率和方法回收率的區(qū)別：方法回收率：表示分析方法的準(zhǔn)確度，加樣回收實(shí)驗(yàn)萃取回收率：指經(jīng)預(yù)處理后能將生物樣品中的藥物用于分析的比例第六十九頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（四）精密度1、方法：要求選擇3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品（含藥物的真實(shí)樣品）同時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。低濃度選擇在定量下限附近，其濃度在定量下限的3倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限；中間選一個(gè)濃度。每一濃度每批至少測(cè)定5個(gè)樣品。2、內(nèi)容：日內(nèi)精密度和日間精密度第七十頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法2.1日內(nèi)精密度：考察分析方法在短期內(nèi)的變異情況2.2日間精密度：考察樣品測(cè)定時(shí)使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線、儀器性能、試劑來(lái)源，以及環(huán)境條件等都可能有微小變化，從而導(dǎo)致分析結(jié)果的變異程度。第七十一頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法2.3進(jìn)行日間精密度的方法：可使用日內(nèi)精密度測(cè)定時(shí)使用的三種藥濃樣品，在一周內(nèi)不同日分別測(cè)定3~5次，計(jì)算RSD。3.精密度數(shù)據(jù)要求：一般可控制在RSD≤15％第七十二頁(yè)，共84頁(yè)。第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（五）定量限定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，要求至少能滿足測(cè)定3~5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10~1/20時(shí)的藥物濃度，其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80%~120%范圍內(nèi)，RSD應(yīng)小于20%。應(yīng)由至少5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品