細菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)培訓班-講-義

目錄一、細菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論-------------3二、BET試驗前的準備------------------------24三、細菌內(nèi)毒素檢查的實驗技術(shù)-------------281，鱟試劑靈敏度復(fù)核-------------------------332，干擾初篩試驗------------------------------403，干擾試驗------------------------------------494，檢查法---------------------------------------62四、細菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)的發(fā)展2007-9-101第一頁，共84頁。一、細菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論1，細菌內(nèi)毒素2，鱟試劑3，BET用水4，BET程序5，2005年版細菌內(nèi)毒素檢查法6，相關(guān)參數(shù)的計算7，試驗的相關(guān)知識2007-9-102第二頁，共84頁。1、細菌內(nèi)毒素

1）化學成分及特性--革蘭氏陰性細菌細胞壁的產(chǎn)物--是高分子量脂多糖復(fù)合物（LPS）

除上述性質(zhì)外，LPS還有許多其他的生物活性致熱性耐熱性酸堿性與鱟試劑反應(yīng)分子極性需要在250攝氏度干熱至少30~60分鐘才能徹底滅活多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性，在水中呈不均勻分布內(nèi)毒素作用于人體細胞，使之釋放內(nèi)原性熱原，

再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)與鱟試劑發(fā)生多級酶促反應(yīng)，形成凝膠與強酸強堿水解反應(yīng)（1）特性2007-9-103第三頁，共84頁。內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu)（2）化學結(jié)構(gòu)--含有3個截然不同的區(qū)域◆O-特異側(cè)鏈◆核心多糖◆類脂A2007-9-104第四頁，共84頁。2）內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系

--內(nèi)毒素是熱原之一種

--醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點是，內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原，控制內(nèi)毒素污染就等于控制熱原污染。3）標準內(nèi)毒素和環(huán)境內(nèi)毒素

1）標準內(nèi)毒素

經(jīng)人工提取精制并經(jīng)生物效價測定的細菌內(nèi)毒素，作為BET檢查的參考品或?qū)φ掌?。主要分參考標準品（RSE）及工作標準品（CSE）。CSE的效價必須用RSE來標化。目前CSE的效價有兩種標示方法：固定效價法（中國）及浮動效價法（國際）。

2）環(huán)境內(nèi)毒素

天然產(chǎn)生的內(nèi)毒素，普遍存在于水、空氣及各種原料中，成分除了脂多糖外還含有較多的蛋白質(zhì)、多糖和其他雜質(zhì)，其極性不明顯，致熱性較標準內(nèi)毒素弱。BET的對象是環(huán)境內(nèi)毒素。2007-9-105第五頁，共84頁。4）標準內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備

1）中國藥典2005年版的BET法規(guī)定，將細菌內(nèi)毒素國家標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后，需在旋渦混合器上混勻15分鐘，以后每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘，其他國家藥典都有類似要求 --具有極性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布

2007-9-106第六頁，共84頁。2、鱟試劑1）鱟試劑的分類--根據(jù)鱟的種類分類美洲鱟試劑(LAL)中國鱟試劑或東方鱟試劑（TAL）--根據(jù)檢查方法分類凝膠法鱟試劑光度法鱟試劑--根據(jù)鱟試劑的反應(yīng)特異性分類普通鱟試劑特異型鱟試劑2007-9-107第七頁，共84頁。2）鱟試劑的規(guī)格--一般分單次試驗試劑和多次試驗試劑（也稱大裝量試劑）--把自身的包裝容器作為反應(yīng)管的試劑稱為單次試驗試劑，在國內(nèi)使用的0.1ml/支的鱟試劑就屬于單次試驗試劑--多次試驗試劑有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用時應(yīng)先用相應(yīng)量的溶解液復(fù)溶鱟試劑。2007-9-108第八頁，共84頁。3）鱟試劑的質(zhì)量標準

--靈敏度定義：再細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，能使鱟試劑產(chǎn)生凝集的標準內(nèi)毒素的最低濃度，單位EU/ml。常用鱟試劑的靈敏度：0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml--自身凝集部頒標準，鱟試劑的陰性對照在37度4小時不產(chǎn)生凝集反應(yīng)--緩沖能力--干燥失重--無菌：中國標準無此項要求2007-9-109第九頁，共84頁。4）鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機理

C因子活化的C因子內(nèi)毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原β葡聚糖或LAL-RM活化的G因子G因子二價陽離子AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物）AC-lle-Glu-Ala-Arg-OHpNA405nm測吸光度值（對硝基苯胺黃色）2007-9-1010第十頁，共84頁。3、BET用水2000年版藥典要求，BET用水應(yīng)為與0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。2005年版藥典要求，凝膠法BET用水應(yīng)為內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水；光度測定法用的BET用水內(nèi)毒素含量應(yīng)少于0.005EU/ml。美國藥典要求的BET用水是指與所使用的鱟試劑不發(fā)生反應(yīng)的滅菌注射用水或其他水。2007-9-1011第十一頁，共84頁。4、BET程序1）驗證實驗?zāi)z法光度測定法2）檢查法凝膠法光度測定法

動態(tài)法

終點法：終點比色法試驗靈敏度的復(fù)核試驗干擾試驗標準曲線可靠性試驗干擾試驗?zāi)z限量試驗?zāi)z半定量試驗動態(tài)比濁法試驗動態(tài)比色法試驗動態(tài)終點法2007-9-1012第十二頁，共84頁。5、《中國藥典》2005年版細菌內(nèi)毒素檢查法1）綜述部分細菌內(nèi)毒素檢查法的定義及BET方法學分類內(nèi)毒素標準品及檢查用水BET器具的要求供試品溶液的要求內(nèi)毒素限值的確定最大有效稀釋倍數(shù)的計算2007-9-1013第十三頁，共84頁。

2）試驗部分（1）凝膠法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗干擾試驗檢查法（2）光度測定法標準曲線的可靠性試驗干擾試驗檢查法3）2005年版藥典BET法際驗部分主要內(nèi)容凝膠限量試驗?zāi)z半定量試驗2007-9-1014第十四頁，共84頁。鱟試驗方法凝膠法光度測定法限量法半定量法動態(tài)法終點法動態(tài)

濁度法動態(tài)顯色法終點濁度法終點

顯色法靈敏度以標示靈敏度表示以標準曲線最低濃度表示預(yù)試驗1靈敏度復(fù)核試驗

各濃度平行4管,NC2管標準曲線驗證試驗

各濃度平行3管，NC2管有效條件①D陰性

②0.5≤c≤2①|(zhì)|≥0.980

②TD＞TC（對動態(tài)法而言）預(yù)試驗2干擾試驗干擾試驗無干擾條件①A、D陰性

②0.5≤Es≤2

0.5Es≤Et≤2Es①|(zhì)|≥0.980

②50%≤R≤200%

③TD＞TC檢查法A、B、C、D各平行2管(共8管)A、B、C、D各平行2管(共12管)有效條件①B、C陽性

②D陰性①|(zhì)|≥0.980

②50%≤R≤200%

③TD＞TC2007-9-1015第十五頁，共84頁。1）內(nèi)毒素限值

（1）藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：L=K/ML為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性單位)表示；K為人每公斤體重每小時科接受的最大內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5EU/(kg·h),放射性藥品注射劑K=2EU/(kg·h),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg·h),M為人每公斤體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)、U/(kg·h)表示，人均體重按60Kg計算，注射試劑若不足1小時，按1小時計算。6、相關(guān)參數(shù)的計算2007-9-1016第十六頁，共84頁。（2）內(nèi)毒素限值計算舉例--注射用的頭孢曲松鈉舒巴坦鈉，成人最大劑量為1500mg/次L==0.20EU/mg--注射用人頭孢孟多酯鈉，成人每日劑量為2.0至8.0g，分3至4次給藥，一日最高劑量不超過12gL==0.075EU/mg--對于大輸液（LVP）,美國藥典（USP）通常都取L值為0.5EU/ml

5EU/(kg·h)1500mg/(60kg·h)5EU/(kg·h)(12000mg/3)/(60kg·h)2007-9-1017第十七頁，共84頁。2）最大有效稀釋倍數(shù)--供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）按以下公式計算MVD=CL/λC為供試品溶液的濃度，其中當L以EU/ml表示時，C為1.0ml/ml;當L以EU/mg或EU/U表示時,C的單位為mg/ml或U/ml。凝膠發(fā)中，λ為鱟試劑的靈敏度光度測定法中，λ為標準曲線最低濃度--如使用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉（濃度為10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀釋倍數(shù)為MVD==8(倍)10mg/mlx0.2EU/mg0.25EU/ml2007-9-1018第十八頁，共84頁。3）最低有效稀釋濃度(MVC)--MVC=λ/L--如使用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉的最低有效濃度為MVC==1.25mg/ml4)樣品稀釋過程中加液量的計算--稀釋過程中，假設(shè)從溶液S1?。▁）ml溶液稀釋（n）倍至S2，加液量為（y）,則滿足：y=(n-1)Xx--如從溶液S1取0.5ml稀釋3.8倍至S2,則加液量為：y=(3.8-1)X0.5=1.4ml即0.5ml的S1加1.4ml稀釋液即得S1的3.8倍稀釋液S20.20EU/mg0.25EU/ml2007-9-1019第十九頁，共84頁。7、試驗相關(guān)知識1)內(nèi)毒素標準品的使用（1）復(fù)溶--復(fù)溶2ml安瓿裝的內(nèi)毒素標準品，為了避免溶液再混合時溢出安瓿，我們建議在安瓿頸部上方開口加液。復(fù)溶液的體積一般為1ml,或根據(jù)使用說明書加液。（2）效價--廠家必須向用戶提供一份效價分析證書（CertificateofAnalysis,CoA）效價分析證書應(yīng)注明：RSE/CSE____EU/mg;_____ng/瓶2007-9-1020第二十頁，共84頁。2)鱟試劑的使用--使用前，應(yīng)將鱟試劑置于室溫環(huán)境下使其大道室溫溫度鱟再復(fù)溶使用--復(fù)溶鱟試劑鱟，應(yīng)避免強烈振動產(chǎn)生泡沫--由于鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的不可逆性，反應(yīng)過程中必須避免反應(yīng)試管的振動造成假陽性3）內(nèi)毒素的清除（1）沖洗適用于器械組件、塞子等可用于加熱等方法提高清除效率（2）蒸餾，折流系統(tǒng)和地心引力阻止大分子量的LPS轉(zhuǎn)變?yōu)檎羝麪顟B(tài)逸出（3）反滲透（4）超濾（5）活性炭吸附2007-9-1021第二十一頁，共84頁。4）內(nèi)毒素的滅活（1）酸/堿水解（2）氧化--H2O2（3）干熱

--250℃，>30分鐘的干烤2007-9-1022第二十二頁，共84頁。二、BET試驗前的準備1.在細菌內(nèi)毒素檢查試驗中，凡是與試驗樣品或試劑接觸的器具必須經(jīng)過除熱原處理。玻璃器皿一般用洗液浸泡4小時后，用自來水沖洗，再用真餾水沖洗、晾干。最后在280℃干烤至少120分鐘。2007-9-1023第二十三頁，共84頁。2.試驗所試用的器具主要包括有：無熱原稀釋管無熱原玻璃移液管無熱原玻璃毛細管稀釋試管架安瓿試管架反應(yīng)試管架可調(diào)移液器連接膠粒無熱原吸頭安瓿開啟器70%的異丙醇浸泡的無紡布拭布2007-9-1024第二十四頁，共84頁。3.實驗中也可用一次性的無熱原塑料器械。如用可調(diào)移液器和無熱原吸頭代替無熱院玻璃移液管取液等。在使用可調(diào)移液器連接無熱原毛細管吸取微量溶液時，采用多吸少打方式。避免由于毛細管的虹吸作用帶來的加樣誤差；也可避免微量加樣時產(chǎn)生氣泡。2007-9-1025第二十五頁，共84頁。4.細菌內(nèi)毒素檢查實驗的恒溫反應(yīng)在37℃的恒溫器中進行。TAL-40型試管恒溫儀（安度斯設(shè)計生產(chǎn)），專門用于細菌內(nèi)毒素檢查的恒溫儀器。具有A,溫度穩(wěn)定；B,加熱均勻；C,定時報警等特點2007-9-1026第二十六頁，共84頁。三、凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)1，凝膠法BET試驗程序2，試驗器具3，鱟試劑靈敏度復(fù)核4，干擾初篩試驗5，干擾試驗6，檢查法2007-9-1027第二十七頁，共84頁。1、凝膠法BET的實驗程序1）試驗準備：試劑、儀器及實驗用具等2）確定供試品的內(nèi)毒素限值（L）3）選擇鱟試劑（λ）4）計算供試品的最大有效稀釋（MVD）或最低有效濃度（MVC）5）鱟試劑靈敏度復(fù)核6）供試品干擾初篩試驗（建議試驗）7）供試品干擾驗證試驗8）供試品日常檢查2007-9-1028第二十八頁，共84頁。2、試驗器具1）器具的要求及處理

--玻璃器皿需除熱原處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后>250℃至少干烤1小時--塑料器械應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械--首選硼硅酸鹽玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具2）孵育反應(yīng)儀器溫度精確：37±0.2℃發(fā)熱均勻：<0.1℃可定時提示：0至90分鐘可設(shè)定定時蜂鳴提示試管免封口2007-9-1029第二十九頁，共84頁。3、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗1）鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗?zāi)康?/p>

1）驗證實驗室的條件是否滿足BET實驗的要求

2）驗證實驗人員的操作技能是否滿足BET實驗的要求3）驗證實驗所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標準品、BET用水等）是否滿足BET實驗的要求2）鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗的步驟

1）恒溫儀器預(yù)熱

2）C溶液（標準內(nèi)毒素溶液）的制備

3）鱟試劑制備

4）加樣及恒溫反應(yīng)

5）結(jié)果判斷

6）數(shù)據(jù)處理2007-9-1030第三十頁，共84頁。稀釋為2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素標準溶液C溶液反應(yīng)：0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管D溶液反應(yīng)：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管單次管：原安瓿多次管：反應(yīng)試管輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合30s旋渦混合器混合15min混勻混合BET水復(fù)溶BET水復(fù)溶RSE或CSE鱟試劑TAL37℃±1℃，60min±2min混勻（水浴恒溫需封口）3）操作步驟示意圖2007-9-1031第三十一頁，共84頁。4）靈敏度復(fù)核試驗舉例(1)試劑試劑名稱廠家規(guī)格標示效價數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支

0.25EU/ml18內(nèi)毒素標準品CSE安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水

安度斯50ml/瓶

＜0.003EU/ml12007-9-1032第三十二頁，共84頁。（2）實驗前，將恒溫儀器預(yù)熱至37℃（3）標準內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min2.0ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml2.0ml3.6ml2.0ml2.0ml0.125EU/ml30s2.0ml2.0ml0.06EU/ml30s2.0ml2.0ml2007-9-1033第三十三頁，共84頁。（4）鱟試劑的準備

取0.1ml裝量，靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑18支，在安瓿頸部折斷，按照陰性對照溶液D兩支，標準內(nèi)毒素溶液每濃度平行4管排列：

用精確移液器準確吸取0.1mlBET水分別加入每支鱟試劑中，使鱟試劑全部溶解0.5U/ml陰性對照溶液D0.25EU/ml0.125EU/ml2007-9-1034第三十四頁，共84頁。CSETAL0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.1ml0.06EU/ml0.1ml0.1mlNC0.1ml（5）加樣用精確移液器分別吸取0.1ml的0.06EU/ml、0.125EU/ml、0.25EU/ml、0.5EU/ml的標準內(nèi)毒素溶液，加入已復(fù)溶的鱟試劑中，每平行4管，吸取0.1mlBET用水（D溶液）加入另外兩支鱟試劑內(nèi)，作為陰性對照。加樣順序一般從低濃度到高濃度2007-9-1035第三十五頁，共84頁。（6）恒溫反應(yīng)

---將加樣完的混合液輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），放入37±1℃的恒溫器中孵育60±2分鐘（孵育過程中避免振動影響凝膠形成）

---若保溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應(yīng)管封口，避免水蒸氣進入反應(yīng)管內(nèi)造成污染。的混合液需封口后再將其放入水浴中恒溫反應(yīng)2007-9-1036第三十六頁，共84頁。（6）結(jié)果判斷

將反應(yīng)試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180℃，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性，記錄為“＋”；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為“-”。＋＋＋＋－－－－陽性陰性結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)180o陽性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性(-)：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者實驗符合要求的基本條件：

NC管全部陰性（－－） 2λ管全部陽性（＋＋＋＋）0.25λ管全部陰性（－－－－）2007-9-1037第三十七頁，共84頁。（7）數(shù)據(jù)處理λc =lg-1（ΣX/4） =lg-1{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0.602)＋(－0.602)]/4} =0.210EU/ml即在本批號鱟試劑的復(fù)核靈敏度（λc）為0.21EU/ml藥典要求：λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2λ）時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度值。結(jié)論：本批TAL的靈敏度標示值符合規(guī)定，按標示值使用!

平行管C溶液(EU/ml)D溶液反應(yīng)終點濃度X（lg反應(yīng)終點濃度）0.50.250.1250.061＋＋＋－－0.125－0.9032＋＋－－－0.25－0.6023＋＋－－－0.25－0.6024＋＋－－－0.25－0.6022007-9-1038第三十八頁，共84頁。4、干擾初篩試驗1）目的及原理：--本試驗是藥品與鱟試劑相容性的篩選試驗，通過對一系列含2λ內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng)，初步篩選出對鱟試驗無干擾的濃度。

--本試驗可減少干擾試驗的盲目性2）試驗步驟①供試品限值的確定②供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定③試劑的選擇④反應(yīng)溶液的制備⑤加樣及反應(yīng)⑥結(jié)果判斷2007-9-1039第三十九頁，共84頁。

（1）供試品限值---硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；---藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U（2）最大有效稀釋倍數(shù)的確定---最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/λ；---使用λ=0.5EU/ml靈敏度的鱟試劑時，MVD0.5=———————————=20倍

---由此可計算出使用不同λ時所對應(yīng)的MVD:3)干擾初篩試驗舉例20000U/mlx0.5EU/1000U0.5EU/ml2007-9-1040第四十頁，共84頁。

靈敏度（EU/ml）0.50.250.1250.060.03對應(yīng)的MVD(倍)204080160320

---由此可計算出使用不同λ時所對應(yīng)的MVD:（3）試劑試劑名稱廠家規(guī)格標示效價數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支

0.25EU/ml24內(nèi)毒素標準品CSE安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水

安度斯50ml/瓶

＜0.003EU/ml12007-9-1041第四十一頁，共84頁。

（4）各反應(yīng)溶液的制備

溶液編號AD溶液內(nèi)容S20S40S80S160S320W平行管溶液編號BC溶液內(nèi)容S20E2S40E2S80E2S160E2S320E2E2平行管2007-9-1042第四十二頁，共84頁。溶液C的制備E100E10E1E0.5溶液A的制備S原液S10S20S40S80

S160S3203.6mlW3.6mlW0.5ml0.4ml0.5mlW3.6mlW0.4ml1.4ml0.4ml1.4ml1.4ml1ml1.4ml1.4mlW1mlW1.4mlW1.4mlW1.4mlW溶液C:E2溶液A2007-9-1043第四十三頁，共84頁。溶液B的制備E1E1E1S20E0.5S40E0.5S80E0.5

S10S20S40

E1E1S160E0.5S320E0.5S80S160注意事項：制備溶液C和B時，每一步的混合液需在旋渦混合器上混合至少30秒

0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml2007-9-1044第四十四頁，共84頁。

（5）加樣及反應(yīng)

用移液器準確吸取0.1mlBET水將鱟試劑復(fù)溶

取0.1ml相應(yīng)溶液C、B、A加入鱟試劑反應(yīng)管，每濃度平行2管

另外取0.1mlBET水作為陰性對照溶液D加入鱟試劑反應(yīng)管2007-9-1045第四十五頁，共84頁。

（4）結(jié)果判斷

溶液編號AD溶液內(nèi)容S20S40S80S160S320W平行管溶液編號BC溶液內(nèi)容S20E2S40E2S80E2S160E2S320E2E2平行管--++--------++++++--++--2007-9-1046第四十六頁，共84頁。--當溶液A、D均為陰性；溶液C均為陽性時，試驗有效。--溶液B系列中，第一個出現(xiàn)陽性結(jié)果的濃度即初步將其判斷為樣品的無干擾濃度。本試驗中的樣品無干擾濃度為≤S402007-9-1047第四十七頁，共84頁。

5、干擾試驗--通過比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對BET檢查有干擾。--至少對3批樣品進行干擾試驗。

1）試驗步驟：

--供試品限值的確定。--鱟試劑的選擇--最大有效稀釋倍數(shù)的確定--反應(yīng)溶液的制備--加樣及反應(yīng)--結(jié)果判斷2007-9-1048第四十八頁，共84頁。何種情況下要做干擾試驗？

——干擾試驗是一個驗證實驗新品種建立BET方法鱟試劑的來源改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的來源改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變試驗環(huán)境中發(fā)生了其它任何有可能影響試驗結(jié)果的變化2007-9-1049第四十九頁，共84頁。

（1）供試品限值

--硫酸慶大霉素，20000U/ml；藥典要求內(nèi)毒素限值L=0.5EU/1000U（2）試劑選擇試劑名稱廠家規(guī)格標示效價數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支

0.125EU/ml36內(nèi)毒素標準品CSE安度斯10ng/瓶10EU/ng（CoA）1BET水

安度斯25ml/瓶

＜0.003EU/ml12007-9-1050第五十頁，共84頁。

--根據(jù)干擾初篩試驗的結(jié)果，供試品在40倍稀釋（對應(yīng)鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml）時無干擾。--一般不選擇第一個出現(xiàn)陽性結(jié)果的供試品濃度作干擾試驗。本試驗我們選擇靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行干擾驗證試驗。（3）最大有效稀釋倍數(shù)的計算MVD=cL/λ=80（倍）MVD＝----------------------------------=80(倍)

20000U/mlX0.5EU/1000U0.125EU/ml2007-9-1051第五十一頁，共84頁。

（4）各反應(yīng)溶液的制備

溶液編號BA溶液內(nèi)容S80E0.25S80E0.125S80E0.06S80E0.03S80平行管溶液編號CD溶液內(nèi)容E0.25E0.125E0.06E0.03

w平行管2007-9-1052第五十二頁，共84頁。溶液C的制備0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min1.8ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml1.8ml3.6ml1.8ml1.8ml0.125EU/ml30s1.8ml1.8ml0.06EU/ml30s1.8ml1.8ml2007-9-1053第五十三頁，共84頁。溶液A的制備（供試品的稀釋）硫酸慶大霉素注射液0.3ml20000U/ml0.6ml1.0mlBET水3.0ml2.7ml1:101:400.6ml1:80S10S40S802007-9-1054第五十四頁，共84頁。溶液B的制備E0.5E0.25S80E0.25S80E0.125S40S40

E0.125E0.0625S80E0.0625S80E0.03125S40S40

0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml2007-9-1055第五十五頁，共84頁。

（5）加樣及反應(yīng)

S80E0.25（S80E2λ）0.25EU/ml（2λ）0.125EU/ml（λ）0.06EU/ml（1/2λ）BET水0.03EU/ml（1/4λ）S80E0.125（S80Eλ）S80E0.06（S80E1/2λ）S80E0.03（S80E1/4λ）S802007-9-1056第五十六頁，共84頁。

--36支鱟試劑，先用0.1mlBET復(fù)溶，再加相應(yīng)的溶液0.1ml

--37±1℃反應(yīng)60±2分鐘（6）結(jié)果判斷2007-9-1057第五十七頁，共84頁。反應(yīng)結(jié)果

溶液編號BA溶液內(nèi)容S80E0.25S80E0.125S80E0.06S80E0.03S80平行管溶液編號CD溶液內(nèi)容E0.25E0.125E0.06E0.03

w平行管+++++-+--+-+++----+++++++-----------2007-9-1058第五十八頁，共84頁。結(jié)果計算及判斷Es=lg-1（∑Xs/4）=lg-1——————=0.125EU/mlEt=lg-1（∑Xt/4）=lg-1————————=0.104EU/mlEs、Et分別為系列C和B的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值。Xs、Xt分別為系列C和B的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。(lg0.125)x44(lg0.06)+(lg0.125)x442007-9-1059第五十九頁，共84頁。結(jié)論：使用靈敏度λ=0.125EU/ml的鱟試劑對樣品（S）的80倍稀釋液（S80）作BET，無干擾。當溶液A和溶液D（陰性對照）的所有平行管都為陰性，且0.5λ≤Es≤2λ時，試驗有效。當0.5Es≤Et≤2.0Es時，供試品在該濃度下對檢查無干擾。本試驗：①0.5λ=0.06，2λ=0.25

Es=0.125，0.5λ≤Es≤2λ，有效②0.5Es=0.06，2Es=0.25Et=0.104，0.5Es≤Et≤2.0Es，無干擾藥典規(guī)定：2007-9-1060第六十頁，共84頁。6、檢查法

1）凝膠法限量試驗（1）反應(yīng)設(shè)置：

溶液編號ABCD溶液內(nèi)容SSE2λE2λW平行管2007-9-1061第六十一頁，共84頁。

（2）試劑選擇試劑名稱廠家規(guī)格標示效價數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支

0.125EU/ml8內(nèi)毒素標準品CSE安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水

安度斯25ml/瓶

＜0.003EU/ml1硫酸慶大霉素(S)---------100ml/支

20000U/ml1--根據(jù)干擾試驗結(jié)果，供試品在80倍稀釋，使用鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml條件下，對BET無干擾--本試驗選擇TAL靈敏度為0.125EU/ml,供試品稀釋80倍檢查2007-9-1062第六十二頁，共84頁。溶液C的制備E100E10E1E0.5E0.25溶液A的制備S原液S10S40S80溶液B的制備

2.7mlW3.6mlW1.6ml0.4ml1.6mlW3.6mlW0.4ml0.6ml0.3ml0.6ml1.8mlW0.6mlW溶液C溶液A0.6ml0.6mlwE0.5S40S80E0.250.6ml0.6ml溶液B(3)各反應(yīng)溶液制備2007-9-1063第六十三頁，共84頁。反應(yīng)項目每管加樣內(nèi)容管數(shù)A0.1mlTAL+0.1mlA溶液B0.1mlTAL+0.1mlB溶液C0.1mlTAL+0.1mlC溶液D0.1mlTAL+0.1mlBET水（4）加樣及反應(yīng)試管封口混合孵育（37℃/60±2分鐘）8支鱟試劑，先加0.1mlBET水復(fù)溶，再加入相應(yīng)溶液（如圖）2007-9-1064第六十四頁，共84頁。溶液編號內(nèi)容A（S80）B（S80E0.25）C（E0.25）DW合格－－＋＋＋＋－－不合格＋＋＋＋＋＋－－需復(fù)檢＋－＋＋＋＋－－復(fù)檢合格－－－－＋＋＋＋－－復(fù)檢不合格＋－－－＋＋＋＋－－試驗無效＋＋試驗無效－－試驗無效－－(5)結(jié)果判斷2007-9-1065第六十五頁，共84頁。舉例：注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素日常檢查試劑名稱廠家劑型復(fù)溶體積或裝量標示靈敏度()或效價數(shù)量

（支）TAL安度斯凍干品0.5ml/支0.125EU/ml3CSE中檢所凍干品1.0ml/支20EU/支1BET水安度斯5ml/支注射用頭孢拉定注射用無菌粉末0.5g/支12007-9-1066第六十六頁，共84頁。1）參數(shù)確定:

①供試品的內(nèi)毒素限值L：《中國藥典》上規(guī)定注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素限值L為0.2EU/mg。②鱟試劑靈敏度的選擇根據(jù)干擾試驗的結(jié)果，可選擇靈敏度為0.125EU/ml的TAL對注射用頭孢拉定按最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)進行日常檢查。

③MVD計算:加5mlBET水溶解一支供試品,得濃度C=100mg/ml的供試液。2007-9-1067第六十七頁，共84頁。2）制備供試液:①供試品溶液（A）的制備0.4ml100mg/ml頭孢拉定5.0mlBET水1:801:100.5ml3.6ml3.5ml1.0ml1.0ml1:1602007-9-1068第六十八頁，共84頁。②內(nèi)毒素溶液（C）的制備0.25EU/ml30s30s15min20EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml2.0EU/ml0.5EU/ml1.0ml1.0ml3.0ml1.0ml3.6mlE0.5E0.252007-9-1069第六十九頁，共84頁。③含2λ內(nèi)毒素的供試液（B）的制備1:160（0.625mg/ml）2λCSE（0.25EU/ml）E0.51.0ml注射用頭孢拉定稀釋液1.0ml1:802007-9-1070第七十頁，共84頁。④加樣反應(yīng)反應(yīng)項目每管加樣內(nèi)容管數(shù)A0.1mlTAL+0.1mlA溶液B0.1mlTAL+0.1mlB溶液C0.1mlTAL+0.1mlC溶液D0.1mlTAL+0.1mlBET水試管封口混合孵育（37℃/60±2分鐘）2007-9-1071第七十一頁，共84頁。2.凝膠法半定量試驗

——應(yīng)用舉例2007-9-1072第七十二頁，共84頁。1.供試品及試劑1.1供試品(S):葡萄糖氯化鈉注射液，

內(nèi)毒素限值L=0.5EU/mL1.2TAL：λ=0.06EU/mL1.3CSE1.4檢查用水（W）2007-9-1073第七十三頁，共84頁。2.凝膠半定量試驗溶液的制備

編號內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水1

2

4

8——

——

——

——2

2

2

2B2λ/供試品溶液12λ2C2λ/檢查用水檢查用水12482λ

1λ

0.5λ

0.25λ2

2

2

2D無/檢查用水——————2注：A為不超過MVD并且通過干擾實驗的供試品溶液，從通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)

開始用檢查用水稀釋成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。

B為2λ濃度標準內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對照）

C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列

D為陰性對照2007-9