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二動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程其中,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。動(dòng)物細(xì)胞工程
常用的技術(shù)手段動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體胚胎移植核移植2020/11/32
燒傷病人的治療通常是取燒傷病人的健康皮膚進(jìn)行自體移植,但對(duì)于大面積燒傷病人來(lái)講,健康皮膚很有限,請(qǐng)同學(xué)們想一想如何來(lái)治療該病人?思考?2020/11/33取該患者的皮膚進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),獲得人造皮膚后再移植2020/11/34(一)、概念是指從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。(二)、原理細(xì)胞分裂增殖一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2020/11/35(三)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程(示意圖)
幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)剪碎組織的目的?胰蛋白酶處理的目的?2020/11/36(四)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性細(xì)胞貼壁:懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上,稱(chēng)為細(xì)胞貼壁。
要求:培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑無(wú)毒、易于貼附。接觸抑制2020/11/37接觸抑制:細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過(guò)程中,隨著細(xì)胞分裂,數(shù)量不斷增加,最后形成一個(gè)單層,此時(shí)細(xì)胞間相互接觸,細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停止,數(shù)量不再增加。50代以后失去接觸抑制接觸抑制2020/11/38原代培養(yǎng):從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞,這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng):將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出,配制成細(xì)胞懸浮液,分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),稱(chēng)為傳代培養(yǎng)。(分瓶培養(yǎng)的過(guò)程)2020/11/393.培養(yǎng)過(guò)程:動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的細(xì)胞、組織或器官細(xì)胞懸浮液→原代培養(yǎng)
(遺傳物質(zhì)不變)細(xì)胞株
細(xì)胞系傳代培養(yǎng)10代細(xì)胞50代細(xì)胞無(wú)限傳代單個(gè)細(xì)胞胰蛋白酶加培養(yǎng)液剪碎細(xì)胞貼壁剝離分瓶部分細(xì)胞“癌變”,遺傳物質(zhì)改變,無(wú)限傳代動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成動(dòng)物體接觸抑制2020/11/310培養(yǎng)器皿2020/11/311
超凈工作臺(tái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)箱倒置顯微鏡2020/11/312(五)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件1、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境(添加一定量的抗生素,定期更換培養(yǎng)液)2、營(yíng)養(yǎng)(葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素、動(dòng)物血清等)3、溫度和PH溫度36.5+0.5度,pH7.2~7.44、氣體環(huán)境O2和CO2(95%空氣和5%CO2)2020/11/313思考與討論1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)取材時(shí),一般是取胚胎組織或幼齡動(dòng)物的組織或器官,請(qǐng)解釋原因?2、用胰蛋白酶分散細(xì)胞,由此可說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分?3、胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉嗎?那將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞時(shí)要注意什么問(wèn)題呢?4、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎?為什么?因?yàn)檫@些組織或器官,分裂能力旺盛,易于培養(yǎng)。主要是蛋白質(zhì)(膠原蛋白等)。能,應(yīng)注意時(shí)間的控制不能,因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4,此環(huán)境下胃蛋白酶(2.0)沒(méi)有活性,而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。2020/11/3146、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么?較植物組織培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處?5、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞?7、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體?主要成分:葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。獨(dú)特之處有:1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動(dòng)物血清等成塊組織不利培養(yǎng),分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)不能,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多,不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體2020/11/315植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖動(dòng)物血清培養(yǎng)結(jié)果植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無(wú)病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白2020/11/316生產(chǎn)蛋白生物制品:病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等健康細(xì)胞培養(yǎng):如獲得大量自身的皮膚細(xì)胞,用于植皮。用于檢測(cè)有毒物質(zhì)用于生理、病理、藥理等方面的研究,為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)(六)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用2020/11/317檢測(cè)有毒物質(zhì)(許多致畸、致癌物質(zhì)加入培養(yǎng)液后,培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異。根據(jù)變異細(xì)胞占全部培養(yǎng)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù),可以判斷某種物質(zhì)的毒性。)為燒傷病人植皮(利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)和接觸抑制特點(diǎn),可以用燒傷病人自己的健康皮膚細(xì)胞培養(yǎng)出大量的自身薄層皮膚細(xì)胞供植皮所需。)2020/11/318
動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)?分化潛能變窄:隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制,分化潛能變窄,這是指整體細(xì)胞而言。細(xì)胞核仍具有全能性:細(xì)胞核,它含有保持物種遺傳性所需的全套基因,而且并沒(méi)有因細(xì)胞分化而丟失基因,因此高度分化細(xì)胞的細(xì)胞核仍具有全能性2020/11/3191970年,有兩位科學(xué)家做了一個(gè)著名的實(shí)驗(yàn):人—鼠細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn),以證明細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子是運(yùn)動(dòng)的。人—鼠細(xì)胞是怎樣實(shí)現(xiàn)融合的?動(dòng)物細(xì)胞融合有什么實(shí)踐意義呢?2020/11/320二、動(dòng)物細(xì)胞融合
細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)兩個(gè)細(xì)胞正在融合受精作用2020/11/321
動(dòng)物細(xì)胞融合也稱(chēng)細(xì)胞雜交,是指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程,融合后形成的具有原來(lái)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞稱(chēng)為雜交細(xì)胞。1.動(dòng)物細(xì)胞融合的概念:2020/11/322滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理:病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用,使細(xì)胞互相凝聚,細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布,細(xì)胞膜打開(kāi),細(xì)胞發(fā)生融合。滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力,但并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。2020/11/323正在融合的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞正在融合的雞血細(xì)胞2.動(dòng)物細(xì)胞融合的原理:細(xì)胞膜的流動(dòng)性2020/11/324細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞生物法:滅活的病毒電激←物理法聚乙二醇←化學(xué)法(如仙臺(tái)病毒)喪失感染活性
(不感染細(xì)胞)保留融合活性
(誘導(dǎo)細(xì)胞融合)滅活仙臺(tái)病毒紫外線(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞融合操作過(guò)程圖解:2020/11/325用滅活的病毒誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程圖細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核2020/11/326植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的比較細(xì)胞融合原理融合方法誘導(dǎo)手段用途植物
體細(xì)胞
雜交細(xì)胞膜的流動(dòng)性去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合離心、電刺激、振動(dòng)、顯微操作、聚乙二醇等試劑誘導(dǎo)克服遠(yuǎn)源雜交不親和,獲得雜交植株動(dòng)物
細(xì)胞
融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合同上,再加上滅活的病毒誘導(dǎo)制備單克隆抗體的技術(shù)之一2020/11/3273.動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用:⑴意義:突破了有性雜交的局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能;
⑵用途:為制造單克隆抗體開(kāi)辟了新途徑。
2020/11/3281.抗體是由何種細(xì)胞產(chǎn)生的?
效應(yīng)B細(xì)胞(漿細(xì)胞)。2.一個(gè)B淋巴細(xì)胞(漿細(xì)胞)能分泌多種抗體嗎?
每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。3.一種抗原侵入機(jī)體之后,引起機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體只有一種嗎?
動(dòng)物在免疫反應(yīng)過(guò)程中,體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類(lèi)可多達(dá)百萬(wàn)種以上。4.簡(jiǎn)述獲得抗體的傳統(tǒng)途徑?
抗原動(dòng)物體抗體抗原不純抗體不純?nèi)慰寺】贵w刺激漿細(xì)胞2020/11/329抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法抗原反復(fù)注射動(dòng)物從動(dòng)物的血清中分離抗體該法制備抗體的缺點(diǎn):產(chǎn)量低、純度低,且抗體的特異性差、靈敏度低。如何解決這個(gè)問(wèn)題呢?單克隆抗體!2020/11/3306.如何獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體?
體外培養(yǎng)單個(gè)B淋巴細(xì)胞,提取分泌的抗體7.體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞能無(wú)限增殖嗎怎樣解決這個(gè)問(wèn)題?5.這種方法獲得的抗體有什么缺陷?
產(chǎn)量低,純度低,特異性差2020/11/331單克隆抗體:雜交瘤細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖(克?。?,形成基因型相同的細(xì)胞群,這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱(chēng)為單克隆抗體。
特點(diǎn):特異性強(qiáng)、靈敏度高
單克隆抗體技術(shù)2020/11/332概括單克隆抗體的概念單:?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞克隆:無(wú)性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)2020/11/333技術(shù)原理:4)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞(獲取大量單克隆抗體)1)單個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生單一抗體(但不能無(wú)限增殖)2)腫瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖(但不能分泌單一抗體)3)細(xì)胞融合技術(shù)雜交瘤細(xì)胞(既無(wú)限增殖又分泌單一抗體)2020/11/334一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖雜交瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)設(shè)計(jì)方案:動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)單克隆抗體既能產(chǎn)生特異性抗體,又能大量增殖的細(xì)胞1975年科學(xué)家米爾斯坦(阿根廷)和柯勒(德國(guó))的實(shí)驗(yàn)2020/11/335單克隆抗體的制備抗原注入小鼠體內(nèi)骨髓瘤細(xì)胞分離B淋巴細(xì)胞細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)選擇培養(yǎng)細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)從腹水提取從培養(yǎng)液提取單克隆抗體能產(chǎn)生抗體能無(wú)限增殖既能產(chǎn)生抗體又能無(wú)限增殖2020/11/336單克隆抗體的制備2020/11/337免疫小鼠培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞注射特定抗原蛋白選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)專(zhuān)一抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體克隆雜交細(xì)胞分開(kāi)不同雜交細(xì)胞,克隆專(zhuān)一抗體,檢驗(yàn)陽(yáng)性細(xì)胞
單克隆抗體制備過(guò)程示意圖多種雜交細(xì)胞2020/11/3382020/11/339①為什么給小鼠注射特定的抗原蛋白?②會(huì)有幾種融合方式?③雜交瘤細(xì)胞是如何篩選出來(lái)的?有何特點(diǎn)?④是否所有的雜交瘤細(xì)胞都能產(chǎn)生專(zhuān)一性抗體?⑤如何大規(guī)模進(jìn)行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體?2020/11/340BB、B瘤、瘤瘤(B、瘤)(一選)選擇性培養(yǎng)基:只有雜交瘤細(xì)胞才能存活獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B細(xì)胞(二選):選能產(chǎn)生所需專(zhuān)一抗體的雜交瘤細(xì)胞√體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn):既能產(chǎn)生特異性抗體,又能大量增殖。2020/11/341整個(gè)制備過(guò)程為何要經(jīng)過(guò)兩次篩選第一次篩選:用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細(xì)胞第二次篩選(克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)):篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。2020/11/342單克隆抗體的制備——體外培養(yǎng)法,動(dòng)物體內(nèi)誘生法?
小鼠腹腔內(nèi)有自然吞噬作用,避免污染;小鼠腹腔本身為雜交瘤的良好培養(yǎng)環(huán)境,使雜交瘤細(xì)胞始終處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。體外培養(yǎng)法——大規(guī)模生產(chǎn)體內(nèi)培養(yǎng)法——小規(guī)模生產(chǎn)2020/11/343單克隆抗體篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系提取經(jīng)過(guò)免疫的B淋巴細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過(guò)程小結(jié):特點(diǎn):既能產(chǎn)生專(zhuān)一抗體又能大量繁殖特點(diǎn):特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備注射抗原免疫2020/11/344單克隆抗體的應(yīng)用1.作為診斷試劑:準(zhǔn)確識(shí)別各種抗原物質(zhì),并與抗原特異性結(jié)合2.用于運(yùn)載藥物:制成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤治療疾?。褐饕糜诎┌Y治療優(yōu)點(diǎn):準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng)、靈敏度高優(yōu)點(diǎn):療效高、毒副作用小2020/11/3454、單抗隆抗體的應(yīng)用①作為診斷試劑②定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病
用于體外診斷人類(lèi)和動(dòng)植物疾病及病原鑒定,純度高、特異性強(qiáng),具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速的優(yōu)點(diǎn)。③用于治療疾病和運(yùn)載藥物
利用同位素標(biāo)記單抗,在特定組織成像
制成生物導(dǎo)彈,將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在的位置,在原位殺死癌細(xì)胞,療效高、副作用小。單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng),靈敏度高,并可以大量制備。2020/11/3462020/11/347
2020/11/348用于治療疾病和運(yùn)載藥物①特異性強(qiáng)、靈敏度高
生物導(dǎo)彈——單克隆抗體+抗癌藥物
②療效高、毒副作用小結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈2020/11/349結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈單抗放射性同位素2020/11/350哺乳動(dòng)物的胚胎移植哺乳動(dòng)物如牛、羊等,妊娠時(shí)間長(zhǎng),每胎產(chǎn)子數(shù)少,繁殖速度比較慢。利用哺乳動(dòng)物的胚胎移植技術(shù),可以快速繁殖優(yōu)良動(dòng)物品種,為畜牧業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了光明的前景。同時(shí),這一技術(shù)也可以用于解決人類(lèi)不育癥問(wèn)題。胚胎移植的過(guò)程:以?xún)?yōu)良種牛的繁殖為例,科學(xué)家們首先用激素促進(jìn)良種母牛多排卵,然后把卵細(xì)胞從母牛體內(nèi)取出,在試管內(nèi)與人工采集的精子進(jìn)行體外受精,培育成胚胎,再把胚胎送入經(jīng)過(guò)激素處理、可以接受胚胎植入的母牛子宮內(nèi),孕育成小牛產(chǎn)出。用這種方法得到的小牛叫做試管牛。利用胚胎移植技術(shù)可以使每頭良種母牛一年繁殖牛犢上百頭。2020/11/351教學(xué)反饋1.動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)最重要的用途是()A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新物種D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞B2.單克隆抗體是由下列哪種細(xì)胞產(chǎn)生的 ()
A.B淋巴細(xì)胞B.T淋巴細(xì)胞C.骨髓瘤細(xì)胞D.雜交瘤細(xì)胞
D3.(多選)1975年米爾斯坦和柯勒成功地獲得了單克隆抗體。下列細(xì)胞中與單克隆抗體的制備有關(guān)的是 ()
A.效應(yīng)B細(xì)胞B.T淋巴細(xì)胞
C.骨髓瘤細(xì)胞D.雜交瘤細(xì)胞
ABCD2020/11/352課后習(xí)題5.單克隆抗體制備過(guò)程中,骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后,要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞,在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是()①淋巴細(xì)胞②小鼠骨髓瘤細(xì)胞③B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞④小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞⑤雜交瘤細(xì)胞A.②④B.①③⑤C.①②③④D.②③C6.動(dòng)物細(xì)胞融合和植物原生質(zhì)融合決定于()
A.細(xì)胞膜的流動(dòng)性B.細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性
C.細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)性D.細(xì)胞質(zhì)酶的活性A2020/11/3537.“生物導(dǎo)彈”是指 ()A.單克隆抗體B.雜交瘤細(xì)胞C.產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞D.在單克隆抗體上連接抗癌藥物
D8.只能使動(dòng)物細(xì)胞融合的常用誘導(dǎo)方法是 ()A.PEGB.滅活的病毒C.電刺激D.離心B二.簡(jiǎn)答題1.淋巴細(xì)胞是由動(dòng)物體---------------------中的---------------------細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)的。2.雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是---------------------骨髓造血干主動(dòng)運(yùn)輸2020/11/3541.動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是:A.動(dòng)物細(xì)胞融合 B.胚胎移植C.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)D.核移植練一練2020/11/3552.在動(dòng)物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞
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