微生物來源的SOD提取分離純化工藝

微生物來源的SOD提取分離純化工藝第1頁/共12頁微生物來源的

SOD制備與活力測(cè)定2第2頁/共12頁SOD研究背景一種金屬酶類與細(xì)胞的需氧代謝密切相關(guān)存在廣泛 大量數(shù)據(jù)表明，所有需氧細(xì)胞包括最簡(jiǎn)單的微生物體內(nèi)都含有SOD。迄今人們已分別從細(xì)菌、真菌,原生動(dòng)物,藻類,昆蟲,植物（如茶葉,大豆,小麥葉片和小白菜等）,動(dòng)物（如肝臟、血液）等生物材料中分離得到SOD。3第3頁/共12頁依據(jù)SOD分子中所含的金屬離子不同，可大致分為以下三類：Cu/Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD。此外，有研究表明，在牛肝中還發(fā)現(xiàn)一種Co/Zn-SOD。三類SOD的性質(zhì)和存在SOD研究背景名稱金屬輔離子顏色分子量λmax(nm)存在Cu/Zn-SODCu,Zn藍(lán)綠色32000258,680主要在真核細(xì)胞胞漿內(nèi)Mn-SODMn粉紅色40000280,457主要來自原核細(xì)胞80000真核生物線粒體Fe-SODFe黃色38000280,350只存在于原核細(xì)胞

4第4頁/共12頁不同生物材料SOD含量差別很大,既使同一生物,不同組織中的SOD含量差別也各不相同。

其中以動(dòng)物肝臟組織中SOD含量最為豐富。

動(dòng)物來源的SOD制備技術(shù)也最為成熟，主要是從動(dòng)物肝臟和血液中提取。價(jià)廉而富含SOD的植物組織和微生物也是制備SOD的理想原料。

SOD研究背景5第5頁/共12頁SOD是需氧微生物在有氧環(huán)境中生存的必要條件，細(xì)菌SOD主要是Mn-SOD和Fe-SOD，也有少量細(xì)菌中含有Cu/Zn-SOD。本實(shí)驗(yàn)擬用傷寒沙門氏菌提取SOD微生物細(xì)胞中SOD的提取純化工藝6第6頁/共12頁提取思路培養(yǎng)細(xì)菌微生物細(xì)胞中SOD的提取純化工藝破壁離心收上清鹽析溶解目的蛋白陰離子離子交換色譜洗脫7SOD等電點(diǎn)：4-5SOD存在于胞漿第7頁/共12頁微生物細(xì)胞中SOD的提取純化工藝具體操作

傷寒沙門氏菌37℃，120r/min搖床培養(yǎng)24h4000r/min離心5min收集細(xì)菌55%硫酸銨鹽析80%硫酸銨鹽析洗3次，懸浮于其中菌體重懸液超聲波法破碎細(xì)胞透析液3000r/min0.05mol/LpH7.8磷酸鉀緩沖液分級(jí)沉淀蛋白沉淀20mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解透析至外液不含NH4+上清液8接種于LB培養(yǎng)基第8頁/共12頁微生物細(xì)胞中SOD的提取純化工藝依次用不同濃度pH7.8的磷酸鉀緩沖液洗脫20mmol/L100ml,30mmol/L100ml,30-100mmol/L200ml流速為0.5ml/min洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/3倍體積濃縮液過DEAE纖維素層析柱（DE-32）DE-32預(yù)先用10mmol/L磷酸鉀緩沖液平衡10-100mmol/L磷酸鉀緩沖液100ml活性產(chǎn)物-30℃保存9透析液過DEAE纖維素層析柱（DE-32）DE-32預(yù)先用20mmol/L磷酸鉀緩沖液平衡洗脫第9頁/共12頁含量測(cè)定---分光光度法

Mn-SOD與Fe-SOD在λ280nm有最大吸收測(cè)樣品A280，參考標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白在A280處做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定濃度。SOD酶活測(cè)定---鄰苯三酚自氧化法

SOD存在下，體系中鄰苯三酚自氧化速率降低，自氧化中間產(chǎn)物積累減少。連續(xù)測(cè)定體系的A420。通過與不含SOD的空白組（自氧化速率控制在0.060A/min）做比較，計(jì)算出自氧化速率在0.030A/min時(shí)的酶量，即為一個(gè)酶活力單位。

SOD含量測(cè)定與活力測(cè)定10第10頁/共12頁討論優(yōu)點(diǎn)：本方法采用硫酸銨分級(jí)沉淀提取法，避免了因有機(jī)溶劑處理使SOD失活的缺點(diǎn)。而且可以同時(shí)分離得到Mn-SOD與Fe-SOD。不足：整個(gè)過程較為復(fù)雜，至少需要2-3次上柱層析總結(jié)：從微生物中提取SOD主要受以下三個(gè)方面影響：提取方