微生物生理生化鑒定

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微生物生理生化鑒定

目的要求基本原理實(shí)驗(yàn)器材操作步驟第2頁/共25頁

目的要求了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理以及在細(xì)菌鑒定中的重要作用掌握通過生理生化反應(yīng)鑒別不同細(xì)菌的基本方法第3頁/共25頁

基本原理糖發(fā)酵試驗(yàn)：是鑒別腸道細(xì)菌的常用生化反應(yīng)。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們?cè)诜纸馓堑哪芰ι嫌泻艽蟮牟町悾绱竽c桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。第4頁/共25頁大腸桿菌：產(chǎn)酸產(chǎn)氣大腸桿菌分解糖類產(chǎn)生多種有機(jī)酸，使培養(yǎng)液呈酸性；產(chǎn)生的甲酸在酸性條件下可進(jìn)一步裂解生成H2和CO2發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，溴甲酚紫指示劑由紫色(pH6.8)變?yōu)辄S色(pH5.2)；氣體的產(chǎn)生可由倒置的德汗氏小管中有無氣泡來證明。糖發(fā)酵試驗(yàn)第5頁/共25頁

乳糖發(fā)酵試驗(yàn)大腸桿菌：+變形桿菌：

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IMViC試驗(yàn)

IMViC是吲哚試驗(yàn)（indoltest）、甲基紅試驗(yàn)（methylredtest）、伏-普試驗(yàn)（Voges-Prokauertest）和檸檬酸鹽試驗(yàn)（citratetest）四個(gè)試驗(yàn)的縮寫。這四個(gè)試驗(yàn)主要用來鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣腸桿菌，而且主要是用于水的細(xì)菌學(xué)檢查，因?yàn)榇竽c桿菌雖非致病菌，但在飲水中若大腸桿菌超過一定數(shù)量則表示受糞便污染，而產(chǎn)氣腸桿菌則廣泛存在于自然界中，因此，檢查水時(shí)要將二者區(qū)分開來。第7頁/共25頁IMViC試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)：用來檢測(cè)細(xì)菌對(duì)色氨酸的利用能力。有些細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸，吲哚本身無色，不能直接觀察到，當(dāng)加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑時(shí)，可形成紅色的玫瑰吲哚。

第8頁/共25頁吲哚試驗(yàn)大腸桿菌：+產(chǎn)氣桿菌：

–陽性陰性第9頁/共25頁IMViC試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)：用來檢測(cè)細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖的產(chǎn)酸能力。當(dāng)細(xì)菌代謝糖大量產(chǎn)酸時(shí)，就會(huì)使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橘黃色（pH6.3）變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)陽性。

第10頁/共25頁甲基紅試驗(yàn)大腸桿菌：+產(chǎn)氣桿菌：–陽性陰性第11頁/共25頁伏-普試驗(yàn)原理產(chǎn)氣桿菌：V.P.試驗(yàn)陽性大腸桿菌：V.P.試驗(yàn)陰性第12頁/共25頁V.P試驗(yàn)大腸桿菌：–產(chǎn)氣桿菌：+陰性陽性第13頁/共25頁IMViC試驗(yàn)檸檬酸鹽試驗(yàn)：用來檢測(cè)細(xì)菌利用檸檬酸的能力。有些細(xì)菌能分解檸檬酸形成CO2，由于培養(yǎng)基中鈉離子的存在而形成碳酸鈉，使pH升高，當(dāng)用溴麝香草酚藍(lán)作為指示劑時(shí)，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化。溴麝香草酚藍(lán)變色范圍為，pH6.0-7.6呈綠色，pH＞7.6時(shí)呈藍(lán)色。第14頁/共25頁

檸檬酸鹽試驗(yàn)大腸桿菌：–產(chǎn)氣桿菌：+陽性陰性第15頁/共25頁

實(shí)驗(yàn)器材菌種：大腸桿菌，普通變形桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌斜面各1支培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基；乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（內(nèi)裝倒置的德漢氏小管）；蛋白胨水培養(yǎng)基；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基儀器或其他用具：培養(yǎng)箱，試管架，接種環(huán)第16頁/共25頁

操作步驟編號(hào)：用記號(hào)筆在各試管上分別標(biāo)明培養(yǎng)基名稱和所接種的菌名。接種：取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管各3支，分別按編號(hào)1支接種大腸桿菌，另1支接種普通變形桿菌，第3支不接種，作為對(duì)照。再將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于2支蛋白胨水培養(yǎng)基、2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基和2支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基中。將上述已接種的試管和對(duì)照管置37℃溫室中培養(yǎng)24~48小時(shí)。觀察結(jié)果。第17頁/共25頁

點(diǎn)燃酒精燈。右手持接種環(huán)，在火焰上灼燒滅菌。試管口靠近火焰旁，用右手的小指與掌間拔掉左手上兩只試管上的棉塞，同時(shí)迅速將試管口在酒精燈上燒灼3s左右，使管口上可能沾染的少量雜菌得以燒死。接種環(huán)輕輕接觸菌苔，取出少許。注意接種環(huán)抽出時(shí)不要碰到管壁和管口。迅速將接種環(huán)伸入另一試管，在培養(yǎng)基上輕輕劃線，接種菌體于其上。劃線時(shí)，要由底部起劃較密的平行線，一直劃到頂部，以充分利用斜面表面積，同時(shí)不要將培養(yǎng)基劃破。燒灼試管口，將棉塞塞上。塞棉塞時(shí)不要移動(dòng)試管，以免在移動(dòng)中納入可能含菌的空氣。將接種針在火焰上燒灼滅菌后放回原處?；静僮鳎ㄐ泵娼臃N法）第18頁/共25頁第19頁/共25頁結(jié)果觀察將葡萄糖蛋白胨水試管中的培養(yǎng)液一分為二，分別用于甲基紅試驗(yàn)和伏-普試驗(yàn)。

甲基紅試驗(yàn)：沿試管壁向培養(yǎng)液加入甲基紅試劑4-6滴，呈鮮紅色者為甲基紅試驗(yàn)陽性，呈橘黃色者為陰性。伏-普試驗(yàn)：在培養(yǎng)液中加入40%KOH溶液10滴，再加入等量的5%萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃溫箱中保溫15-30min如培養(yǎng)液呈紅色為反應(yīng)陽性。

第20頁/共25頁結(jié)果觀察糖發(fā)酵試驗(yàn)：產(chǎn)酸：指示劑使培養(yǎng)基由紫色（pH6.8）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（pH5.2）；產(chǎn)氣：倒置的德漢氏小管內(nèi)有氣泡產(chǎn)生。吲哚試驗(yàn)：在培養(yǎng)液中加入乙醚約1ml，充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中。靜置片刻，待乙醚層浮于液面后形成明顯的乙醚層，再沿管壁加入吲哚試劑8-10滴。如有吲哚存在，則乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性反應(yīng)。

第21頁/共25頁結(jié)果觀察檸檬酸