微生物生理學幻燈片

微生物生理學幻燈片第1頁/共83頁營養(yǎng)——是指生物體從外部環(huán)境中攝取對生命活動必需的能量和物質(zhì)，以滿足正常生長和繁殖需要的一種最基本的生理功能。營養(yǎng)物——指具有營養(yǎng)功能的物質(zhì)，在微生物學中，它還包括非常規(guī)物質(zhì)形式的光輻射能在內(nèi)?？煞譃榱箢悾禾荚?、氮源、生長因子、無機鹽、水、能源。按營養(yǎng)元素的需要量分：

大量元素有碳、氮、氫、氧、磷、硫、鉀、鎂、鈣、鐵（需要量在10-4mol/L以上）

微量元素有鋅、錳、鈉、氯、鉬、硒、鈷、銅、鎢、鎳、硼等（需要量在10-4mol/L以下）第2頁/共83頁10種大量元素來源與生理功能元素來源在代謝中的功能C各種有機物、CO2構成細胞物質(zhì)的主要成分OO2、H2O、各種有機物、CO2構成細胞物質(zhì)的主要成分HH2、H2O、各種有機物構成細胞物質(zhì)的主要成分NNH4+、NO2-、N2、各種有機物構成細胞物質(zhì)的主要成分SSO42-，HS-、S、S2O32-、各種有機硫化物構成含硫氨基酸、硫胺素、輔酶A、生物素、硫辛酸等PHPO42-磷脂、核苷酸、核酸等KK+細胞內(nèi)主要的無機陽離子，某些酶的輔因子，構成物質(zhì)運輸系統(tǒng)MgMg2+許多酶（如激酶）的輔因子，存在于細胞壁和細胞膜中，維持細胞結構的穩(wěn)定CaCa2+某些酶的輔因子，存在于胞外酶（如淀粉酶、蛋白酶）中，是芽孢內(nèi)的重要元素FeFe2+、Fe3+構成細胞色素、鐵氧還蛋白、鐵硫蛋白的成分、某些脫水酶的輔因子第3頁/共83頁微量元素來源與生理功能元素來源在代謝中的功能ZnZn2+參與醇脫氫酶、堿性磷酸酯酶、醛縮酶、RNA聚合酶或DNA聚合酶的活動MnMn2+參與細菌超氧化歧化酶的活動，也是某些酶（PEP脫羧酶、檸檬酸合成酶）的輔助因子NaNa+耐高鹽細菌所需ClCl-耐高鹽細菌所需MoMoO42+參與硝酸鹽還原酶、固氮酶和甲酸脫氫酶的活動SeSeO32-參與甘氨酸還原酶和甲酸脫氫酶的活動CoCo2+參與帶輔酶B12的一些酶（如谷氨酸變位酶和甲基丙二酰-COA變位酶）的活動CuCu2+參與細胞色素氧化酶和加氧酶的活動WWO42-參與甲酸脫氫酶的活動NiNi2+參與脲酶的活動，氫-氧化細菌在自養(yǎng)生長時也需要Ni第4頁/共83頁與營養(yǎng)有關的幾個概念生長因子是一類調(diào)節(jié)微生物正常代謝所必需，但不能用簡單的碳源、氮源自行全合成的有機物。狹義的一般僅指維生素；廣義的生長因子除了維生素外，還包括堿基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺類、C4~C6的分支或直鏈脂肪酸，有時還包括氨基酸營養(yǎng)缺陷突變株所需要的氨基酸在內(nèi)。水活度：指在一定的溫度和壓力條件下，溶液中的蒸汽壓力與同樣條件下純水的蒸汽壓力之比（相對濕度）。微生物生長所要求的aw值通常在0.66~0.99之間變動碳氮比（C/N）：碳源中碳元素摩爾數(shù)與氮源中氮元素摩爾數(shù)之比。內(nèi)源酸堿調(diào)節(jié)劑和外源酸堿調(diào)節(jié)劑第5頁/共83頁水活度的計算及表示第6頁/共83頁維生素與有關化合物在代謝中的作用化合物在代謝中的作用對氨基苯甲酸四氫葉酸前體，一碳單位轉(zhuǎn)移酶的輔酶生物素催化羧化反應的酶（即羧化酶）的輔酶輔酶M甲烷形成中的輔酶葉酸構成一碳單位轉(zhuǎn)移酶的輔酶氯高鐵血紅素細胞色素的前體硫辛酸丙酮酸脫氫酶復合物的輔基尼克酸NAD、NADP的前體，它們是許多脫氫酶的輔基吡哆醇（B6）磷酸吡哆醛是轉(zhuǎn)氨酶、氨基酸脫氨酶的輔基核黃素（B2）FMN和FAD的前體，黃素蛋白的輔基B12催化分子重排反應的酶的輔基（谷氨酸變位酶）硫胺素（B1）硫胺素焦磷酸脫羧酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶維生素K甲醌類的前體、起電子載體的作用（如延胡索酸還原酶）第7頁/共83頁營養(yǎng)物的生理功能①參與細胞結構或細胞物質(zhì)的組成；②構成酶活性基團或組成物質(zhì)的運輸系統(tǒng)；③通過代謝為機體完成各種生理活動提供所需要的能量。第8頁/共83頁微生物的營養(yǎng)類型

（能源和碳源不同劃分）營養(yǎng)類型能源氫供體基本碳源實例光能無機營養(yǎng)型（光能自養(yǎng)型）光無機物CO2藍細菌、紫硫細菌、綠硫細菌、藻類光能有機營養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型）光有機物CO2及簡單有機物紅螺菌科的細菌（即紫色無硫細菌）化能無機營養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型）無機物*無機物CO2硝化細菌、硫化細菌、鐵細菌、氫細菌、硫黃細菌等化能無機營養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型）有機物有機物有機物絕大多數(shù)細菌和全部真核微生物*NH4+、NO2-、S0、H2S、H2、Fe2+等第9頁/共83頁一、物質(zhì)傳送的研究方法研究物質(zhì)傳送所面臨的困難：1、在生活細胞里，有由不同成分組成的復雜的運輸系統(tǒng)（細胞膜囊）——成分的復雜性；2、在生活細胞里，對一種物質(zhì)或同類物質(zhì)有一種以上的運輸方式，這樣在分析結果時難以確定某種物質(zhì)的運輸是以何種方式完成的——運輸方式的多樣性。3、物質(zhì)進入細胞后，往往被機體迅速分解與利用，機體分解與利用這種物質(zhì)的能力也直接影響該物質(zhì)運輸?shù)乃俾剩ㄍ蛔凅w、同位素標記）——缺乏穩(wěn)定性（不可測）。第10頁/共83頁細胞膜囊通常是將細菌細胞經(jīng)過一定的方式處理之后，由細胞膜組成一種膜的囊泡，這種細胞膜囊還存在物質(zhì)運輸系統(tǒng)與產(chǎn)能系統(tǒng)（主動運輸系統(tǒng)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和呼吸鏈中的電子載體等），所以可作研究物質(zhì)運輸與能量的關系，以及研究氨基酸與糖類的運輸。原生質(zhì)體裂解→細胞膜→形成細胞膜囊第11頁/共83頁二、影響物質(zhì)傳送的因素某種物質(zhì)能否作為營養(yǎng)物質(zhì)支持微生物生長，首先取決于這種物質(zhì)能否進入細胞，其次還要取決于微生物是否具有利用這種物質(zhì)的能力——運輸和分解（轉(zhuǎn)化）兩個過程（針對物質(zhì)）。所有微生物都具有一種能夠保護機體完整性和能夠限制物質(zhì)進出細胞的屏障——滲透屏障（針對細胞構造）。第12頁/共83頁㈠、微生物細胞的表面結構影響物質(zhì)運輸?shù)娜龑咏Y構（涉及前章所述）

1、莢膜、粘液層（疏松結構——影響較小，增加粘性——阻礙物質(zhì)擴散）

2、細胞壁——分子屏障——孔徑固定（有時有蛋白參與——孔蛋白），具有一定分子量選擇（較大）

3、原生質(zhì)膜（特異選擇性，最重要）——直接影響物質(zhì)的運輸——一般只針對小分子物質(zhì)。第13頁/共83頁㈡、物質(zhì)本身的特性物理化學特性的影響：分子量小、溶解度大的物質(zhì)比分子量大、溶解度小的物質(zhì)更容易被機體吸收；電負性強弱也影響物質(zhì)運輸（中性容易吸收）。第14頁/共83頁㈢、微生物的生活環(huán)境生物機體的生活環(huán)境直接影響著物質(zhì)的跨膜運輸，一般需要注意的“環(huán)境問題”——即在生活環(huán)境中是否存在及狀態(tài)如何：①能誘導某種物質(zhì)運輸系統(tǒng)形成的物質(zhì)（蛋白質(zhì)合成）；②呼吸的抑制劑與解偶聯(lián)劑（能量）；③被運輸物質(zhì)的結構類似物等（競爭性抑制）。第15頁/共83頁環(huán)境pH值和溫度的影響大腸桿菌——對甲胺的吸收（聯(lián)系細胞膜的特性）物質(zhì)解離——甲胺（pKb=3.37

），弱堿性物質(zhì)，在中性或堿性條件下可發(fā)生解離，以CH3NH3+存在，在酸性環(huán)境下以CH3NH2存在；

酸性環(huán)境下，胞內(nèi)>環(huán)境時（pH），進入積累于胞內(nèi)，以CH3NH3+存在，不易分泌；堿性環(huán)境下，胞內(nèi)<環(huán)境時（pH），環(huán)境中存在CH3NH3+不易吸收；溫度——物質(zhì)的溶解度、膜流動性和運輸系統(tǒng)的蛋白（酶）活性。第16頁/共83頁三、物質(zhì)傳送的方式及其機理㈠、小分子營養(yǎng)物質(zhì)的基本吸收方式㈡、主動運輸中的能量偶聯(lián)機理㈢、幾類主要營養(yǎng)物質(zhì)的吸收㈣、微生物對大分子物質(zhì)的吸收和分泌第17頁/共83頁㈠、小分子營養(yǎng)物質(zhì)的基本吸收方式1、單純（被動）擴散——指營養(yǎng)物質(zhì)高濃度部位向低濃度部位運動的過程；2、促進擴散——指營養(yǎng)物質(zhì)在載體蛋白（透過酶）協(xié)助下進行擴散的運輸方式；3、主動運輸——指可將溶質(zhì)分子進行逆濃度梯度運輸?shù)倪\輸方式；4、基團轉(zhuǎn)（移）位（PTS—磷酸烯醇式丙酮酸：糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)）——許多原核生物在進行跨膜運輸時，被運輸?shù)奈镔|(zhì)發(fā)生化學變化。第18頁/共83頁被動擴散和促進擴散被動擴散濃度梯度促進擴散運輸速度第19頁/共83頁促進擴散第20頁/共83頁主動運輸（兩種方式）根據(jù)推動運輸?shù)哪芰啃问?，分為兩種方式：ATP結合依賴型質(zhì)子梯度依賴型第21頁/共83頁ATP結合依賴型ATP結合性盒型轉(zhuǎn)運蛋白（ABC轉(zhuǎn)運蛋白）——結合蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)——由兩個疏水跨膜域組成并與胞內(nèi)的兩個核苷酸結合域形成復合物（底物-結合蛋白結合）；第22頁/共83頁質(zhì)子梯度依賴型利用質(zhì)子梯度（鈉離子梯度）來推動物質(zhì)的主動運輸（大腸桿菌的乳糖透過酶）；鈉離子梯度的建立：——細菌（原核生物）以質(zhì)子（H+）逆向運輸（不同物質(zhì)以相反方向同時進行跨膜運輸?shù)姆绞剑?；——真核生物以ATP的水解作用產(chǎn)生的。第23頁/共83頁主動運輸（ABC轉(zhuǎn)運蛋白）第24頁/共83頁基團轉(zhuǎn)（移）位——PTSPTS的主要過程：①酶Ⅰ磷酸化（存在于細胞質(zhì)中）；②熱穩(wěn)載體蛋白（HPr，低分子質(zhì)量，存在于細胞質(zhì)中）的激活（磷酸化）；③酶Ⅱ磷酸化（結構多變，3亞基構成——EⅡA、EⅡB、EⅡC）少數(shù)微生物存在酶Ⅲ；酶Ⅱ（酶Ⅲ）具有特異性。

④糖經(jīng)磷酸化而運入細胞膜內(nèi)。被運輸物質(zhì)結構發(fā)生改變（膜內(nèi)外）。第25頁/共83頁基團移位的模型（甘露醇和葡萄糖）第26頁/共83頁基團轉(zhuǎn)位的說明并非所有能夠在葡萄糖中生長的細菌都具有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，主要存在于兼性和嚴格的厭氧細菌中，好氧菌中現(xiàn)今未發(fā)現(xiàn)？。對于厭氧菌來說，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)非常重要，因為它有助于節(jié)省ATP（糖的磷酸化減少很多步驟，直接傳遞磷酸高能鍵）——其生物學意義所在（兩個方面）?！獏捬跚闆r下ATP產(chǎn)生不充足。第27頁/共83頁磷酸交換反應或基團交換反應

鼠傷寒沙門氏菌在胞內(nèi)不存在酶Ⅰ、HPr和酶Ⅲ時，酶Ⅱ也可以催化胞內(nèi)的磷酸糖與胞外糖之間的轉(zhuǎn)磷酸反應，不會改變胞內(nèi)磷酸糖的濃度，但可以避免有毒害作用的磷酸糖在胞內(nèi)積累——對機體起保護作用。第28頁/共83頁其它運輸系統(tǒng)胞飲（呑噬作用）——是某些微生物通過趨向性向某種營養(yǎng)物質(zhì)運動，靠近該物質(zhì)并將該物質(zhì)吸附到膜表面，然后在該物質(zhì)附著的地方細胞膜開始內(nèi)陷，膜逐步包圍該物質(zhì)，最后形成一種含有這種物質(zhì)的膜囊，膜囊離開細胞膜而游離細胞質(zhì)中。胞飲占多數(shù)，非主動進行；吞噬作用存在于少數(shù)，主動進行（偽足）——二者的差別。

第29頁/共83頁必要說明微生物經(jīng)常通過多種運輸系統(tǒng)吸收某一種營養(yǎng)物質(zhì)，例如大腸桿菌至少有5種運輸系統(tǒng)用來吸收半乳糖，各有3個系統(tǒng)吸收谷氨酸和亮氨酸，有2個系統(tǒng)吸收鉀離子。在這種情況下，不同運輸系統(tǒng)所消耗的能源、對營養(yǎng)物質(zhì)的親合力及運輸系統(tǒng)的調(diào)節(jié)方式等都有差別。微生物這種運輸方式的多樣性賦予微生物在多變環(huán)境條件下更強的競爭優(yōu)勢。第30頁/共83頁4種運送營養(yǎng)物質(zhì)方式的比較比較項目單純擴散促進擴散主動運輸基團轉(zhuǎn)位特異載體蛋白無有有有運送速度慢快快快溶質(zhì)運送方向由濃至稀由濃至稀由稀至濃由稀至濃平衡時內(nèi)外濃度內(nèi)外相等內(nèi)外相等內(nèi)部濃度高得多內(nèi)部濃度高得多運送分子無特異性特異性特異性特異性能量消耗不需要不需要需要需要運送前后溶質(zhì)分子不變不變不變改變載體飽和效應無有有有與溶質(zhì)類似物無競爭性有競爭性有競爭性有競爭性運送抑制劑無有有有運送對象舉例H2O、CO2、O2、甘油、乙醇、少數(shù)氨基酸、鹽類、代謝抑制劑SO42-、PO43-、糖（真核生物）氨基酸、乳糖等糖類，Na+、Ca2+等無機離子葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等第31頁/共83頁4種運送營養(yǎng)物質(zhì)方式第32頁/共83頁㈡、主動運輸中的能量偶聯(lián)機理

質(zhì)子動力理論

ATP動力型理論

直接偶聯(lián)學說第33頁/共83頁質(zhì)子動力理論——質(zhì)子梯度建立主動運輸中需要的能源，在多數(shù)系統(tǒng)中的是以質(zhì)子動力來完成的——建立電位差或質(zhì)子濃度差，使細胞膜充能（激化），形成能化膜。是由光能和化學能推動產(chǎn)生的，主要方式：1、光能：含有細菌葉綠素的光合細菌和含有其它色素的細菌，在吸收光量子以后，排出質(zhì)子，從而建立起細胞膜內(nèi)外表面的質(zhì)子濃度差。2、呼吸所產(chǎn)生的質(zhì)子移動力：電子從合適的電子供體[如NAD（P）H]沿電子傳遞鏈傳到氧生成水，同時伴有質(zhì)子排出，從而建立膜內(nèi)外兩側(cè)的電位差或質(zhì)子濃度。3、細胞內(nèi)的ATP在ATP酶的水解下，放出能量，同時伴有質(zhì)子外排，結果形成膜兩側(cè)的電位差。第34頁/共83頁細胞內(nèi)外質(zhì)子濃度差的建立A：呼吸；B：ATP水解；C：光合細菌；C—Cytc第35頁/共83頁主動運輸?shù)念愋统跫壷鲃舆\輸——電子傳遞系統(tǒng)、光合細菌光合作用和ATP酶作用引起質(zhì)子（也包括其它陽離子）運輸?shù)姆绞剑ㄍ馀牛镔|(zhì)運輸所需能量的獲得——建立電化學梯度。次級主動運輸——由膜內(nèi)外電勢梯度變化引起的物質(zhì)運輸方式，根據(jù)被運輸?shù)奈镔|(zhì)與質(zhì)子（或其它離子）移動的方向不同又可以將其分為同向運輸、單向運輸和逆向運輸三種類型。第36頁/共83頁次級主動運輸?shù)娜N類型同向運輸——指兩種不同的物質(zhì)通過同一載體按同一個方向運輸?shù)姆绞?；單向運輸——是一種通過載體使帶電荷的或不帶電荷的物質(zhì)進入細胞或輸出細胞的運輸方式，運輸?shù)慕Y果是導致陽離子在胞內(nèi)積累或?qū)е掳麅?nèi)陰離子濃度降低，或者膜內(nèi)外的電位差不發(fā)生變化，類似于促進擴散；逆向運輸——是兩種物質(zhì)通過同一載體，按相反的方向進行運輸?shù)姆绞?。?7頁/共83頁利用質(zhì)子梯度（鈉離子梯度）來推動物質(zhì)的主動運輸

第38頁/共83頁主動運輸中載體蛋白的運輸模式第39頁/共83頁ATP動力型理論是直接利用ATP或和其有關的高能磷酸鍵結合的能量，L-谷氨酰氨、L-鳥氨酸和D-核糖等通過此方式運輸。和質(zhì)子動力型的不同點：質(zhì)子動力型對氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑（二硝基酚等）高度敏感，ATP動力型則不受影響；基質(zhì)在細胞內(nèi)積蓄的結果不同，質(zhì)子動力型可以使細胞內(nèi)外濃度梯度達到103倍，ATP動力型可以達到106倍。雖然ATP動力型高效，但其如何利用高能磷酸鍵運輸物質(zhì)還不完全清楚（Na+-K+-ATP）。設計試驗證明之。第40頁/共83頁Na+-K+-ATPNa+-K+

泵構成：由2個大亞基、2個小亞基組成的4聚體，實際上就是Na+-K+-ATP酶，分布于動物細胞的質(zhì)膜。Na+--K+

泵工作原理：

（1）Na+-K+-ATP酶通過磷酸化和去磷酸化過程發(fā)生構象的變化，導致與Na+、K+的親和力發(fā)生變化。

（2）在膜內(nèi)側(cè)Na+與酶結合，激活ATP酶活性，使ATP分解，酶被磷酸化，構象發(fā)生變化，與Na+結合的部位轉(zhuǎn)向膜外側(cè)；這種磷酸化的酶對Na+的親和力低，對K+的親和力高，因而在膜外側(cè)釋放Na+、而與K+結合。

（3）K+與磷酸化酶結合后促使酶去磷酸化，酶的構象恢復原狀，于是與K+結合的部位轉(zhuǎn)向膜內(nèi)側(cè)，K+與酶的親和力降低，使K+在膜內(nèi)被釋放，而又與Na+結合。

（4）每一循環(huán)消耗一個ATP；轉(zhuǎn)運出三個Na+，轉(zhuǎn)進兩個K+。Na+-K+泵的作用：①維持細胞的滲透性，保持細胞的體積；②維持低Na+高K+的細胞內(nèi)環(huán)境；③維持細胞的靜息電位。第41頁/共83頁Na+-K+-ATP第42頁/共83頁ATP動力型主動運輸?shù)哪Ｐ偷?3頁/共83頁直接偶聯(lián)學說ATP動力型中特殊類型，分二步完成（第一步為富集作用；第二步為ATP動力型通過細胞膜進入細胞內(nèi)）。某些G-細菌中，還需要一種結合蛋白（bindingproteins）——具特異性，在周質(zhì)空間內(nèi)，有富集的作用，然后由透過酶運輸?shù)侥?nèi)，需ATP——大腸桿菌中阿拉伯糖、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及硫酸鹽離子等的吸收。第44頁/共83頁㈢、幾類主要營養(yǎng)物質(zhì)的吸收1、糖的吸收促進擴散、主動運輸、基團轉(zhuǎn)位，多種運輸方式——多系統(tǒng)吸收2、肽與氨基酸的吸收主動運輸肽——識別與結合階段；轉(zhuǎn)位階段；肽的釋放與載體復原階段3、離子的吸收微生物生長所需要的一些金屬離子通常是在特定的載體分子作用下經(jīng)主動運輸?shù)姆绞轿瞻麅?nèi)的第45頁/共83頁鐵的吸收鐵在環(huán)境中的高價態(tài)——Fe3+——難溶性鐵載體的引入——形成復合物——氧肟酸鹽或兒茶酚鹽3個鐵載體圍繞一個鐵形成六對稱的八面體復合物第46頁/共83頁鐵載體鐵載體是一類能與Fe3+形成復合物并將其運輸進入細胞內(nèi)的小分子物質(zhì)，通常為氧肟酸鹽或酚鹽——兒茶酚鹽第47頁/共83頁微生物產(chǎn)生的鐵-螯合因子第48頁/共83頁㈣、微生物對大分子物質(zhì)的吸收

和分泌大分子營養(yǎng)物質(zhì)如多糖、脂肪、蛋白質(zhì)及核酸等，一般來說不能透過微生物細胞質(zhì)膜，需要先經(jīng)過相應的酶（胞外酶）的作用，將之分解為小分子物質(zhì)后，才能被運送到細胞內(nèi)。但也發(fā)現(xiàn)某些微生物在特定條件下，可能直接把核酸、蛋白質(zhì)吸收到體內(nèi)，或分泌到體外。第49頁/共83頁1、核酸的吸收——轉(zhuǎn)化試驗枯草芽孢桿菌和肺炎雙球菌等細菌的轉(zhuǎn)化作用——直接吸收具有雙鏈螺旋結構的DNA（106——15kb，感受態(tài)），經(jīng)常應用于基因工程。感受態(tài)——是指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。第50頁/共83頁核酸吸收的機制酶受體學說——表面上具有一種酶，作為DNA通過的受體，具特異性（蛋白質(zhì)合成的抑制劑，可以抑制這種感受性）？——相當于載體的作用局部化原生質(zhì)體學說——含自溶酶，使肽聚糖肽鏈斷裂（N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶）——感受促進因子（感受態(tài)鏈球菌培養(yǎng)液含不耐熱蛋白質(zhì)，可以使相近的鏈球菌屬中非感受態(tài)細胞變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞）——核酸先附著于細胞表面，然后通過某種形式與能量偶聯(lián)，吸收進入細胞內(nèi)。第51頁/共83頁2、蛋白質(zhì)的吸收現(xiàn)象：枯草芽孢桿菌（生產(chǎn)α-淀粉酶）——污染環(huán)狀芽孢桿菌，使發(fā)酵液酶活力降低。排除蛋白酶等的作用——未檢測到蛋白酶活性；——排除酶降解。加入無菌發(fā)酵液（過濾除菌），α-淀粉酶活力不下降；——排除發(fā)酵液存在影響因子。只有加入環(huán)狀芽孢桿菌活菌體下降；破碎菌體或死菌體不下降；——確定菌的作用。結論：產(chǎn)生的酶蛋白可能被吸收。第52頁/共83頁具有蛋白質(zhì)吸收的菌體細胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)菌體細胞膜沒有變化，細胞壁變薄，細胞壁中多糖類減少，細胞呈膨脹狀態(tài)——可能由于細胞壁結構減弱，酶蛋白越過壁和膜結合，膜內(nèi)陷使之進入細胞內(nèi)。第53頁/共83頁3、細胞的分泌作用（胞外酶的分泌機制，4種）在通過不同方式吸收營養(yǎng)物的同時，也可以向外分泌無機鹽、有機酸、糖類、氨基酸、嘧啶、嘌呤等小分子物質(zhì)；分泌具有45000~77000左右分子量的蛋白質(zhì)（酶類、外毒素等），不可能僅靠擴散作用來完成。胞外酶的分泌機制研究較多，主要有以下幾種說法（4種）：第54頁/共83頁①分泌作用與胞外酶化學結構有關——分子量?。ú怀^8萬），幾乎不含（半）胱氨酸——二硫鍵少、結構可變——直鏈穿過細胞膜——再形成二、三級結構（α-淀粉酶——細胞內(nèi)存在其前體物質(zhì)，通過細胞膜后被活化，膜上沒有活性，所以認為活化和分泌同時進行）。第55頁/共83頁②從酶合成位置來說明分泌機制——蛋白質(zhì)不能通過細胞膜，其合成可能在細胞膜外合成（合成蛋白質(zhì)的核糖體在膜內(nèi)，這樣就形成了矛盾；最好的解釋：可能是在細胞膜內(nèi)折形成的間體內(nèi)合成酶或酶的前體）——間體外翻；細胞內(nèi)合成亞基，分泌到膜外，在周質(zhì)空間組成酶蛋白（G-菌少有間體——大腸桿菌產(chǎn)的堿性磷酯酶）。第56頁/共83頁③從細胞表層結構方面來解釋細胞的分泌機制——胞外酶的合成一般在菌體對數(shù)期后合成，產(chǎn)生類似溶菌酶的自溶酶和能夠引起原生質(zhì)體溶解的熱穩(wěn)定性物質(zhì)——減弱了細胞壁、細胞膜的結構——分泌（枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶；肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)肉毒素——65000Da的蛋白質(zhì)）第57頁/共83頁④酶蛋白的分泌與酶的修飾有關——地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的青霉素酶向細胞外分泌時，在酶蛋白末端Ser（絲氨酸）上連接上一個磷脂酸（增加疏水性）——容易通過疏水性的細胞膜被分泌到膜外（磷脂蛋白質(zhì)）。枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的果聚糖生成酶；解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的膜結合型淀粉酶——注意：過膜后，通過細胞壁分泌到細胞外還不清楚。第58頁/共83頁信號肽假說（Blobel）mRNA的5’-端有一個75個堿基的信號序列——信號肽——引導核糖體結合到膜的特定位置（受體蛋白）——形成蛋白通道——膜外切割（信號肽酶）；信號肽——15~32個氨基酸殘基，末端是親水區(qū)段，帶正電荷，與之相連的是以疏水氨基酸為主的疏水核心（分泌時起重要作用）；α-淀粉酶、白喉毒素、堿性磷脂酶等真核微生物酶蛋白的分泌比原核微生物復雜，胞內(nèi)合成的酶蛋白要經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體形成分泌泡囊被排出胞外。第59頁/共83頁蛋白質(zhì)跨膜運輸?shù)男盘柤僬f示意圖第60頁/共83頁四、營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)恼{(diào)節(jié)

㈠、載體物質(zhì)合成的調(diào)節(jié)

㈡、載體物質(zhì)生理活性的調(diào)節(jié)

1、膜電勢調(diào)節(jié)

2、cAMP環(huán)化酶和透過酶共同調(diào)節(jié)

3、胞內(nèi)磷酸糖的調(diào)節(jié)第61頁/共83頁關于運輸?shù)恼{(diào)節(jié)說明物質(zhì)的交換——吸收和分泌。涉及載體物質(zhì)（單純擴散除外）——蛋白質(zhì)——運輸?shù)恼{(diào)節(jié)涉及到載體物質(zhì)的合成與載體物質(zhì)的生理活性。目前關于物質(zhì)運輸系統(tǒng)合成的調(diào)節(jié)了解很少，這里僅就大腸桿菌己糖磷酸運輸系統(tǒng)和鼠傷寒沙門氏菌PTS中酶Ⅰ與HPr操縱子的調(diào)節(jié)做簡單介紹。第62頁/共83頁㈠、載體物質(zhì)合成的調(diào)節(jié)

——涉及操縱子學說

在大腸桿菌的己糖磷酸運輸系統(tǒng)合成調(diào)節(jié)中有兩種蛋白質(zhì)起著重要作用：一種是存在于細胞質(zhì)中的活化蛋白質(zhì)A，一種是位于細胞膜上的轉(zhuǎn)膜調(diào)節(jié)蛋白（MR）?；罨鞍踪|(zhì)A對編碼運輸?shù)鞍撞倏v子的控制區(qū)有親和力，但它也可以結合到調(diào)節(jié)蛋白MR上——選擇性可逆；轉(zhuǎn)膜調(diào)節(jié)蛋白（MR）在細胞膜外表面有一個6-磷酸葡萄糖的結合位點。第63頁/共83頁當6-磷酸葡萄糖結合到MR上以后，降低了MR對活化蛋白質(zhì)A的親和力，這時A從MR上釋放下來，然后結合到運輸?shù)鞍撞倏v子操縱基因上，促進操縱子轉(zhuǎn)錄，合成6-磷酸葡萄糖運輸系統(tǒng)，有利于物質(zhì)吸收。當胞外不存在6-磷酸葡萄糖時，活化蛋白質(zhì)A與MR的親合力高，A不能結合到操縱子的操縱基因上，轉(zhuǎn)錄過程不能開始，運輸系統(tǒng)不能合成，6-磷酸葡萄糖不被吸收。第64頁/共83頁大腸桿菌己糖磷酸運輸操縱子的誘導調(diào)節(jié)方式——Saier1979提出的調(diào)節(jié)方式第65頁/共83頁后來又有人提出在這種調(diào)節(jié)方式中還有一種蛋白質(zhì)C在活化蛋白質(zhì)A與轉(zhuǎn)膜調(diào)節(jié)蛋白MR之間起連接作用，控制著蛋白質(zhì)A與MR的結合。第66頁/共83頁Shattuck-Eidens和Kadner等人1983年提出的調(diào)節(jié)方式第67頁/共83頁鼠傷寒沙門氏菌PTS操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)鼠傷寒沙門氏菌葡萄糖運輸系統(tǒng)PTS中的酶Ⅰ和HPr的合成操縱子PTS的調(diào)節(jié)與調(diào)節(jié)蛋白Rp磷酸化與去磷酸化過程有關；磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白（Rp-P）可能是起一種阻遏蛋白的作用。去磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白（Rp）可能是起一種激活劑的作用；當葡萄糖加入細胞懸液里以后，調(diào)節(jié)蛋白上的磷酸轉(zhuǎn)移到葡萄糖，這時去磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白Rp直接結合到PTS操縱子控制區(qū)上，誘導PTS操縱子轉(zhuǎn)錄；當葡萄糖不存在時，磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白（Rp-P）則結合到PTS操縱子控制區(qū)，阻止了PTS操縱子的轉(zhuǎn)錄。第68頁/共83頁鼠傷寒沙門氏菌PTS操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)第69頁/共83頁㈡、載體物質(zhì)生理活性的調(diào)節(jié)物質(zhì)運輸系統(tǒng)中載體物質(zhì)生理活性調(diào)節(jié)方式主要是在糖的運輸中進行研究的，研究的結果表明糖運輸系統(tǒng)生理活性的調(diào)節(jié)有膜電勢調(diào)節(jié)、胞內(nèi)磷（硫）酸糖的調(diào)節(jié)與cAMP環(huán)化酶與透過酶的共同調(diào)節(jié)等調(diào)節(jié)方式。第70頁/共83頁1、膜電勢（氧化還原電勢）調(diào)節(jié)在微生物里，某些與物質(zhì)運輸有關的酶只有在膜電勢存在的條件下才有最大的活性。鼠傷寒沙門氏菌的檸檬酸透過酶與磷酸甘油酸透過酶的最大活性就需要膜電勢存在。膜電勢可以通過基質(zhì)氧化的方式產(chǎn)生，也可以通過加入氧化劑的方式直接產(chǎn)生。這種膜電勢可以使還原型的葡萄糖酶Ⅱ（-SH）轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷拿涪颍?S-S-）。在PTS系統(tǒng)中還原型酶Ⅱ?qū)\輸?shù)幕|(zhì)親和力高，氧化型酶Ⅱ?qū)\輸?shù)幕|(zhì)親和力低，在這兩種狀態(tài)中，親和力高低可以相差100倍以上。第71頁/共83頁膜電勢調(diào)節(jié)膜電勢增加（膜內(nèi)更負）可能促使酶Ⅱ氧化，糖與酶Ⅱ的親和力降低（從能量的角度來看，供能已充足，不再大量運輸物質(zhì)進入細胞氧化供能）。糖的結合能促進酶Ⅱ的還原，酶Ⅱ的磷酸化作用可以提高酶的氧化程度。第72頁/共83頁相關實驗在膜囊里，D-乳酸是一種有效的電子供體，氰化物是一種吸收的抑制劑，這兩種物質(zhì)在脯氨酸的吸收上會產(chǎn)生相反的作用。乳酸加入會促進脯氨酸吸收，但在加入草氨酸（D-乳酸脫氫酶的一種強抑制劑）和氰化物時，抵消了乳酸加入時的促進作用。說明這兩種物質(zhì)加入是通過阻止建立膜電勢的方式降低膜囊對脯氨酸的吸收。第73頁/共83頁先看一個相關試驗將在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長的細菌收集起來，經(jīng)無糖的無機鹽液體培養(yǎng)基洗滌之后，重新懸浮在無糖培養(yǎng)基里，經(jīng)過一段時間后；進行2種處理及結果：在上述系統(tǒng)中加入乳糖，則機體能以最大的速率吸收乳糖；在上述系統(tǒng)中加入葡萄糖后，再加入乳糖，則機體基本上不吸收乳糖。