微生物代謝工程的基本概念

微生物代謝工程的基本概念第1頁/共36頁2023/4/521.

微生物細胞能為其自身提供代謝能

2.細胞能量轉換機構的組成

3.微生物代謝中的電子流和電子回路

4.生物氧化和輔酶的再生

5.生化反應途徑和代謝途徑

6.生化反應網(wǎng)絡和代謝網(wǎng)絡

7.代謝網(wǎng)絡的聯(lián)網(wǎng)問題

8.代謝流和碳架物質(zhì)流

9.代謝主流介紹26個基本概念：第2頁/共36頁2023/4/5310.載流途徑與載流路徑

11.代謝主流的變動性和選擇性

12.理想載流途徑

13.微生物生物工程的難題

14.代謝網(wǎng)絡的節(jié)點及其剛性

15.工業(yè)發(fā)酵的五字策略

16.代謝網(wǎng)絡的節(jié)點及其剛性

17.代謝網(wǎng)絡的剛性

18.微生物活細胞和細胞的經(jīng)濟性

第3頁/共36頁2023/4/5419.正常代謝和競爭型細胞經(jīng)濟

20.異常代謝和導向型細胞經(jīng)濟

21.細胞經(jīng)濟受到嚴格的制約

22.信息流指導下的工業(yè)發(fā)酵

23.限制性遺傳信息之謎

24.從發(fā)酵工程到代謝工程

25.代謝工程

26.代謝流及其控制的分析

第4頁/共36頁2023/4/551.微生物細胞能為其自身提供代謝能

微生物細胞的生存方式與動物、植物等高等生物的細胞不同，微生物細胞能獨立存在、自主生活。因此每個微生物細胞都具有能量轉換機構，這種機構可把其它形式的能量轉換成能被其自身直接使用的能量(如ATP、GTP和儲存在膜上的質(zhì)子運動勢ΔP)，暫且把它們稱為代謝能。在代謝能的直接支撐下，活細胞才能維持其高度有序的狀態(tài)。第5頁/共36頁2023/4/562.細胞能量轉換機構的組成

微生物細胞的能量轉換機構包括：需要代謝能來激活的代謝途徑的有關的酶和這些酶的輔酶、原核微生物的細胞質(zhì)膜和真核微生物線粒體的內(nèi)膜，以及這些膜上的電子傳遞鏈和ATP酶，還有在能量代謝和主動輸送中起輔助作用的有關載體系統(tǒng)。

第6頁/共36頁2023/4/573.微生物細胞代謝的電子流和電子回路

工業(yè)發(fā)酵普遍使用的化能異養(yǎng)型微生物靠生物氧化把化學能轉化為可被微生物直接利用的代謝能。微生物細胞的生物氧化過程必須借助于輔酶，并且其生物氧化過程和跨膜的主動輸送過程伴隨著電子（或質(zhì)子）的流動，形成微生物代謝的跨膜的質(zhì)子回路?！鞠吕m(xù)】

第7頁/共36頁2023/4/58ATPATP酶呼吸鏈微生物代謝的跨膜質(zhì)子回路示意圖電子回路示意圖第8頁/共36頁2023/4/594.生物氧化和輔酶的再生

在微生物活細胞中，參與生物氧化反應的脫氫酶的輔酶本身不能跨過膜，被局限在其所在的細胞空間內(nèi)。它們必須被再生，才能回用，以維持能量代謝。脫氫酶的輔酶在細胞的氧化還原反應中接受電子而被還原成還原型輔酶，還原型輔酶把電子釋放給電子受體，從而實現(xiàn)脫氫酶的輔酶的再生。根據(jù)最終電子受體的類型，可把生物氧化分成有氧呼吸、無氧呼吸和發(fā)酵三種類型。第9頁/共36頁2023/4/5105.生化反應途徑和代謝途徑

一系列按序進行的生物化學反應構成生化反應途徑；若這條途徑在活細胞里運行，則為代謝途徑。

第10頁/共36頁2023/4/5116.生化反應網(wǎng)絡和代謝網(wǎng)絡

生化反應途徑按生物化學規(guī)律匯成生化反應網(wǎng)絡；代謝途徑與跨膜輸送系統(tǒng)按代謝規(guī)律匯成（物質(zhì)）代謝網(wǎng)絡。

第11頁/共36頁2023/4/5127.代謝網(wǎng)絡的聯(lián)網(wǎng)問題

代謝中間化合物都在代謝網(wǎng)絡上，有些有機化合物雖然不在代謝網(wǎng)絡上但仍有可能與代謝網(wǎng)絡“聯(lián)網(wǎng)”。所謂“聯(lián)網(wǎng)”就是用化學或生物化學反應把指定的化合物連接到代謝網(wǎng)絡上去，從而使它與微生物的代謝建立聯(lián)系?！奥?lián)網(wǎng)”可以用化學或生物學方法(含DNA重組技術)來實現(xiàn)。廣義的“聯(lián)網(wǎng)”包含代謝網(wǎng)絡細節(jié)不同的生命有機體之間接力賽式的代謝聯(lián)系。已在“網(wǎng)”上或者可以“聯(lián)網(wǎng)”的化合物都可能被開發(fā)為工業(yè)發(fā)酵的產(chǎn)物或原料。

第12頁/共36頁2023/4/5138.代謝流和碳架物質(zhì)流

代謝物在代謝網(wǎng)絡中流動形成代謝流。廣義的代謝流還包括能量流和信息流。在代謝分析和代謝工程中，代謝流往往首先是指有機物流(碳架物質(zhì)流)。

第13頁/共36頁2023/4/5149.代謝主流

在一定的培養(yǎng)條件下，代謝物在代謝網(wǎng)絡中流動，流量相對集中的代謝流叫做該培養(yǎng)條件下的代謝主流。代謝主流的流量測定是代謝工程的重要組成部分。第14頁/共36頁2023/4/51510.載流途徑與載流路徑

從字面上講，有代謝物流通過的代謝途徑即載流途徑。載流路徑是工業(yè)發(fā)酵領域的術語。在工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物生產(chǎn)階段，碳架物質(zhì)從原料到目的產(chǎn)物流經(jīng)的各段代謝途徑(即載流途徑)，按流經(jīng)的先后次序首尾銜接，組合成載流路徑。代謝工程沒有必要研究所有的載流途徑，但必須研究載流路徑上的代謝流，也就是生產(chǎn)階段的代謝主流。第15頁/共36頁2023/4/51611.代謝主流的變動性和選擇性

微生物的代謝主流的方向、流量甚至所流經(jīng)的途徑都可能發(fā)生變化。這就是微生物代謝主流的變動性和代謝主流對代謝網(wǎng)絡中的途徑的選擇性。這種變動和選擇的根據(jù)在微生物細胞的遺傳物質(zhì)，選擇的原因是微生物所處的環(huán)境條件的變化。第16頁/共36頁2023/4/51712.理想載流路徑

為了提高產(chǎn)物對原料的轉化率，就要求代謝主流(根據(jù)代謝分析的結果)經(jīng)設定的載流路徑流到目的產(chǎn)物。因為這樣的載流路徑是帶有主觀導向性的虛擬的載流途徑，所以把它們叫做理想載流路徑。第17頁/共36頁2023/4/51813.微生物代謝工程的難題

既然微生物的代謝主流對網(wǎng)絡中的途徑有自主的選擇性，而工業(yè)發(fā)酵的目標又是要微生物的代謝主流經(jīng)過理想載流途徑，流到目的產(chǎn)物，因此就有必要去解決理想載流途徑的設計問題和對代謝主流的合理導向問題。

第18頁/共36頁2023/4/51914.代謝的“五段式”

在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)器中的微生物細胞的代謝是分步進行的。胞外營養(yǎng)物質(zhì)(一般要經(jīng)胞外酶降解后)從培養(yǎng)介質(zhì)跨膜進入細胞，(一般要)經(jīng)過“向心途徑”、“中心途徑”和“離心途徑”等連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內(nèi)生成目的產(chǎn)物，最后，目的產(chǎn)物跨過細胞質(zhì)膜排出細胞回到培養(yǎng)介質(zhì)中。

【下續(xù)】第19頁/共36頁2023/4/520工業(yè)發(fā)酵中細胞機器運行階段理想載流路徑的五段式：1、胞外酶對原料的降解及營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的過程2、經(jīng)胞內(nèi)降解代謝途徑匯入中心代謝途徑3、中心代謝途徑及其控制4、合成代謝流及其控制5、目的產(chǎn)物的跨膜及其控制第20頁/共36頁2023/4/521因此，典型的理想載流途徑應該由以上五段承擔不同代謝分工的依次銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”。在這條載流途徑上流動的代謝主流對應地也有五段，這就是代謝主流的“五段式”。第21頁/共36頁2023/4/52215.工業(yè)發(fā)酵的五字策略

在“載流路徑”、“代謝主流”和“五段式”等概念的基礎上，從統(tǒng)籌的角度出發(fā)，提出作為一個整體用于設計育種以及發(fā)酵工藝控制的五字策略：

“進、通、節(jié)、堵、出”

【下續(xù)】第22頁/共36頁2023/4/523①進，促進細胞對碳源營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；②通，使來自上游和各個注入分支的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物；

③節(jié)，阻塞與目的產(chǎn)物的形成無關或關系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對集中地流向目的產(chǎn)物；

④堵，消除或削弱目的產(chǎn)物進一步代謝的途徑；

⑤出，促進目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。第23頁/共36頁2023/4/52416.代謝網(wǎng)絡的節(jié)點及其剛性

微生物代謝網(wǎng)絡中的途徑的交叉點(代謝流的集散處)叫做節(jié)點(node)，微生物自動抵制節(jié)點處代謝物流量分配比率的改變的特性叫做節(jié)點的剛性。節(jié)點的剛性取決于微生物代謝的自動調(diào)節(jié)機制。因此在應用“五字策略”制訂育種方案時必須認真考慮節(jié)點剛性問題，盡量采用解除反饋調(diào)節(jié)的育種手段。第24頁/共36頁2023/4/52517.代謝網(wǎng)絡的剛性

微生物自動抵制代謝網(wǎng)絡中代謝物流量分布的改變的特性叫做代謝網(wǎng)絡的剛性。代謝網(wǎng)絡的剛性與主要剛性節(jié)點的剛性大小、分布及數(shù)量密切相關。第25頁/共36頁2023/4/52618.微生物活細胞及其經(jīng)濟性

微生物活細胞是個遠離平衡狀態(tài)的開放體系，是一種靠消耗能量而維持低熵的穩(wěn)定動態(tài)的特殊結構——耗散結構?！鞠吕m(xù)】第26頁/共36頁2023/4/527從微生物細胞對能量和化學物質(zhì)的內(nèi)外交換、增收節(jié)支、協(xié)調(diào)自律等客觀規(guī)律出發(fā)，把微生物細胞作為按特殊的經(jīng)濟規(guī)律運行的經(jīng)濟實體來看待，并且把這種按特殊的經(jīng)濟規(guī)律運行的有利于生存競爭（生存保障）的新陳代謝特性叫做細胞經(jīng)濟性。細胞的經(jīng)濟性可以以生成細胞的質(zhì)量與消耗底物的質(zhì)量之比值——細胞經(jīng)濟系數(shù)來衡量。第27頁/共36頁2023/4/52819.正常代謝和競爭型細胞經(jīng)濟

微生物在生存競爭中進化的方向是發(fā)展其自身的適應能力和提高細胞運行的經(jīng)濟系數(shù)。經(jīng)生存競爭而幸存下來的野生型微生物在其所棲身的環(huán)境中是富有競爭能力的，并且它們的代謝中間物在代謝網(wǎng)絡中的分布及細胞經(jīng)濟運行狀況有利于細胞生長、繁殖和在競爭中獲勝。在上述條件下，細胞處于正常代謝狀態(tài)，細胞經(jīng)濟體系呈現(xiàn)競爭型細胞經(jīng)濟的特色。第28頁/共36頁2023/4/52920.異常代謝和導向型細胞經(jīng)濟

如果工業(yè)生產(chǎn)要求微生物在胞外累積某種代謝中間產(chǎn)物，則必須對微生物的代謝流進行導向。根據(jù)已獲得的代謝分析的信息，應用“五字策略”有可能設計理想載流途徑和配套的發(fā)酵培養(yǎng)工藝路線和工藝條件，進而改造菌種、調(diào)整工藝，將代謝主流導向理想載流途徑。在導向成功的情況下，細胞處于異常代謝狀態(tài)，細胞經(jīng)濟體系呈現(xiàn)導向型細胞經(jīng)濟的特色。第29頁/共36頁2023/4/53021.細胞經(jīng)濟受到嚴格的制約

工業(yè)發(fā)酵依靠細胞群體的代謝來獲得產(chǎn)品，導向型細胞經(jīng)濟固然有利于特定的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，但競爭型細胞經(jīng)濟向導向型細胞經(jīng)濟的轉化受到能量代謝、還原力的平衡等條件的嚴格制約(以保證有熵的輸出)，表現(xiàn)出代謝網(wǎng)絡的剛性。若細胞經(jīng)濟實體的運行狀態(tài)過度偏離競爭型運行狀態(tài)，活細胞的高度有序狀態(tài)將走向無序，最終導致細胞經(jīng)濟的崩潰。第30頁/共36頁2023/4/53122.信息流指導下的工業(yè)發(fā)酵

在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，可以把微生物細胞看作是細胞機器，它們進行能量代謝和物質(zhì)代謝；同時又可以把它們看作是信息處理器，它們復制和傳遞自己的生物信息，接收細胞內(nèi)外的物理、化學甚至生物信息，并在對內(nèi)外信息流進行綜合處理的基礎上，發(fā)出代謝調(diào)控的指令，在網(wǎng)絡剛性的范圍之內(nèi)控制微生物細胞自身的生命活動。第31頁/共36頁2023/4/53223.限制性遺傳信息之謎

可以推測在每個微生物細胞的遺傳物質(zhì)中必有其限制性的生死攸關的遺傳信息，它們規(guī)定微生物細胞生命活動的基本的代謝網(wǎng)絡及其調(diào)節(jié)機制。這些遺傳信息是微生物細胞能夠自主生活與獨立存在的依據(jù)，也是微生物對環(huán)境的有限的適應性以及設計育種的計劃往往不能完全兌現(xiàn)的內(nèi)在原因。第32頁/共36頁2023/4/53324.從發(fā)酵工程到代謝工程