微生物代謝工程的基本概念

微生物代謝工程的基本概念第1頁/共36頁2023/4/521.

微生物細(xì)胞能為其自身提供代謝能

2.細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換機構(gòu)的組成

3.微生物代謝中的電子流和電子回路

4.生物氧化和輔酶的再生

5.生化反應(yīng)途徑和代謝途徑

6.生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)

7.代謝網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)網(wǎng)問題

8.代謝流和碳架物質(zhì)流

9.代謝主流介紹26個基本概念：第2頁/共36頁2023/4/5310.載流途徑與載流路徑

11.代謝主流的變動性和選擇性

12.理想載流途徑

13.微生物生物工程的難題

14.代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點及其剛性

15.工業(yè)發(fā)酵的五字策略

16.代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點及其剛性

17.代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性

18.微生物活細(xì)胞和細(xì)胞的經(jīng)濟性

第3頁/共36頁2023/4/5419.正常代謝和競爭型細(xì)胞經(jīng)濟

20.異常代謝和導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟

21.細(xì)胞經(jīng)濟受到嚴(yán)格的制約

22.信息流指導(dǎo)下的工業(yè)發(fā)酵

23.限制性遺傳信息之謎

24.從發(fā)酵工程到代謝工程

25.代謝工程

26.代謝流及其控制的分析

第4頁/共36頁2023/4/551.微生物細(xì)胞能為其自身提供代謝能

微生物細(xì)胞的生存方式與動物、植物等高等生物的細(xì)胞不同，微生物細(xì)胞能獨立存在、自主生活。因此每個微生物細(xì)胞都具有能量轉(zhuǎn)換機構(gòu)，這種機構(gòu)可把其它形式的能量轉(zhuǎn)換成能被其自身直接使用的能量(如ATP、GTP和儲存在膜上的質(zhì)子運動勢ΔP)，暫且把它們稱為代謝能。在代謝能的直接支撐下，活細(xì)胞才能維持其高度有序的狀態(tài)。第5頁/共36頁2023/4/562.細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換機構(gòu)的組成

微生物細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換機構(gòu)包括：需要代謝能來激活的代謝途徑的有關(guān)的酶和這些酶的輔酶、原核微生物的細(xì)胞質(zhì)膜和真核微生物線粒體的內(nèi)膜，以及這些膜上的電子傳遞鏈和ATP酶，還有在能量代謝和主動輸送中起輔助作用的有關(guān)載體系統(tǒng)。

第6頁/共36頁2023/4/573.微生物細(xì)胞代謝的電子流和電子回路

工業(yè)發(fā)酵普遍使用的化能異養(yǎng)型微生物靠生物氧化把化學(xué)能轉(zhuǎn)化為可被微生物直接利用的代謝能。微生物細(xì)胞的生物氧化過程必須借助于輔酶，并且其生物氧化過程和跨膜的主動輸送過程伴隨著電子（或質(zhì)子）的流動，形成微生物代謝的跨膜的質(zhì)子回路?！鞠吕m(xù)】

第7頁/共36頁2023/4/58ATPATP酶呼吸鏈微生物代謝的跨膜質(zhì)子回路示意圖電子回路示意圖第8頁/共36頁2023/4/594.生物氧化和輔酶的再生

在微生物活細(xì)胞中，參與生物氧化反應(yīng)的脫氫酶的輔酶本身不能跨過膜，被局限在其所在的細(xì)胞空間內(nèi)。它們必須被再生，才能回用，以維持能量代謝。脫氫酶的輔酶在細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)中接受電子而被還原成還原型輔酶，還原型輔酶把電子釋放給電子受體，從而實現(xiàn)脫氫酶的輔酶的再生。根據(jù)最終電子受體的類型，可把生物氧化分成有氧呼吸、無氧呼吸和發(fā)酵三種類型。第9頁/共36頁2023/4/5105.生化反應(yīng)途徑和代謝途徑

一系列按序進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)構(gòu)成生化反應(yīng)途徑；若這條途徑在活細(xì)胞里運行，則為代謝途徑。

第10頁/共36頁2023/4/5116.生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)

生化反應(yīng)途徑按生物化學(xué)規(guī)律匯成生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)；代謝途徑與跨膜輸送系統(tǒng)按代謝規(guī)律匯成（物質(zhì)）代謝網(wǎng)絡(luò)。

第11頁/共36頁2023/4/5127.代謝網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)網(wǎng)問題

代謝中間化合物都在代謝網(wǎng)絡(luò)上，有些有機化合物雖然不在代謝網(wǎng)絡(luò)上但仍有可能與代謝網(wǎng)絡(luò)“聯(lián)網(wǎng)”。所謂“聯(lián)網(wǎng)”就是用化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)把指定的化合物連接到代謝網(wǎng)絡(luò)上去，從而使它與微生物的代謝建立聯(lián)系。“聯(lián)網(wǎng)”可以用化學(xué)或生物學(xué)方法(含DNA重組技術(shù))來實現(xiàn)。廣義的“聯(lián)網(wǎng)”包含代謝網(wǎng)絡(luò)細(xì)節(jié)不同的生命有機體之間接力賽式的代謝聯(lián)系。已在“網(wǎng)”上或者可以“聯(lián)網(wǎng)”的化合物都可能被開發(fā)為工業(yè)發(fā)酵的產(chǎn)物或原料。

第12頁/共36頁2023/4/5138.代謝流和碳架物質(zhì)流

代謝物在代謝網(wǎng)絡(luò)中流動形成代謝流。廣義的代謝流還包括能量流和信息流。在代謝分析和代謝工程中，代謝流往往首先是指有機物流(碳架物質(zhì)流)。

第13頁/共36頁2023/4/5149.代謝主流

在一定的培養(yǎng)條件下，代謝物在代謝網(wǎng)絡(luò)中流動，流量相對集中的代謝流叫做該培養(yǎng)條件下的代謝主流。代謝主流的流量測定是代謝工程的重要組成部分。第14頁/共36頁2023/4/51510.載流途徑與載流路徑

從字面上講，有代謝物流通過的代謝途徑即載流途徑。載流路徑是工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域的術(shù)語。在工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物生產(chǎn)階段，碳架物質(zhì)從原料到目的產(chǎn)物流經(jīng)的各段代謝途徑(即載流途徑)，按流經(jīng)的先后次序首尾銜接，組合成載流路徑。代謝工程沒有必要研究所有的載流途徑，但必須研究載流路徑上的代謝流，也就是生產(chǎn)階段的代謝主流。第15頁/共36頁2023/4/51611.代謝主流的變動性和選擇性

微生物的代謝主流的方向、流量甚至所流經(jīng)的途徑都可能發(fā)生變化。這就是微生物代謝主流的變動性和代謝主流對代謝網(wǎng)絡(luò)中的途徑的選擇性。這種變動和選擇的根據(jù)在微生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，選擇的原因是微生物所處的環(huán)境條件的變化。第16頁/共36頁2023/4/51712.理想載流路徑

為了提高產(chǎn)物對原料的轉(zhuǎn)化率，就要求代謝主流(根據(jù)代謝分析的結(jié)果)經(jīng)設(shè)定的載流路徑流到目的產(chǎn)物。因為這樣的載流路徑是帶有主觀導(dǎo)向性的虛擬的載流途徑，所以把它們叫做理想載流路徑。第17頁/共36頁2023/4/51813.微生物代謝工程的難題

既然微生物的代謝主流對網(wǎng)絡(luò)中的途徑有自主的選擇性，而工業(yè)發(fā)酵的目標(biāo)又是要微生物的代謝主流經(jīng)過理想載流途徑，流到目的產(chǎn)物，因此就有必要去解決理想載流途徑的設(shè)計問題和對代謝主流的合理導(dǎo)向問題。

第18頁/共36頁2023/4/51914.代謝的“五段式”

在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)器中的微生物細(xì)胞的代謝是分步進(jìn)行的。胞外營養(yǎng)物質(zhì)(一般要經(jīng)胞外酶降解后)從培養(yǎng)介質(zhì)跨膜進(jìn)入細(xì)胞，(一般要)經(jīng)過“向心途徑”、“中心途徑”和“離心途徑”等連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內(nèi)生成目的產(chǎn)物，最后，目的產(chǎn)物跨過細(xì)胞質(zhì)膜排出細(xì)胞回到培養(yǎng)介質(zhì)中。

【下續(xù)】第19頁/共36頁2023/4/520工業(yè)發(fā)酵中細(xì)胞機器運行階段理想載流路徑的五段式：1、胞外酶對原料的降解及營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的過程2、經(jīng)胞內(nèi)降解代謝途徑匯入中心代謝途徑3、中心代謝途徑及其控制4、合成代謝流及其控制5、目的產(chǎn)物的跨膜及其控制第20頁/共36頁2023/4/521因此，典型的理想載流途徑應(yīng)該由以上五段承擔(dān)不同代謝分工的依次銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”。在這條載流途徑上流動的代謝主流對應(yīng)地也有五段，這就是代謝主流的“五段式”。第21頁/共36頁2023/4/52215.工業(yè)發(fā)酵的五字策略

在“載流路徑”、“代謝主流”和“五段式”等概念的基礎(chǔ)上，從統(tǒng)籌的角度出發(fā)，提出作為一個整體用于設(shè)計育種以及發(fā)酵工藝控制的五字策略：

“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”

【下續(xù)】第22頁/共36頁2023/4/523①進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞對碳源營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；②通，使來自上游和各個注入分支的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物；

③節(jié)，阻塞與目的產(chǎn)物的形成無關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對集中地流向目的產(chǎn)物；

④堵，消除或削弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑；

⑤出，促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。第23頁/共36頁2023/4/52416.代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點及其剛性

微生物代謝網(wǎng)絡(luò)中的途徑的交叉點(代謝流的集散處)叫做節(jié)點(node)，微生物自動抵制節(jié)點處代謝物流量分配比率的改變的特性叫做節(jié)點的剛性。節(jié)點的剛性取決于微生物代謝的自動調(diào)節(jié)機制。因此在應(yīng)用“五字策略”制訂育種方案時必須認(rèn)真考慮節(jié)點剛性問題，盡量采用解除反饋調(diào)節(jié)的育種手段。第24頁/共36頁2023/4/52517.代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性

微生物自動抵制代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝物流量分布的改變的特性叫做代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性。代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性與主要剛性節(jié)點的剛性大小、分布及數(shù)量密切相關(guān)。第25頁/共36頁2023/4/52618.微生物活細(xì)胞及其經(jīng)濟性

微生物活細(xì)胞是個遠(yuǎn)離平衡狀態(tài)的開放體系，是一種靠消耗能量而維持低熵的穩(wěn)定動態(tài)的特殊結(jié)構(gòu)——耗散結(jié)構(gòu)?！鞠吕m(xù)】第26頁/共36頁2023/4/527從微生物細(xì)胞對能量和化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)外交換、增收節(jié)支、協(xié)調(diào)自律等客觀規(guī)律出發(fā)，把微生物細(xì)胞作為按特殊的經(jīng)濟規(guī)律運行的經(jīng)濟實體來看待，并且把這種按特殊的經(jīng)濟規(guī)律運行的有利于生存競爭（生存保障）的新陳代謝特性叫做細(xì)胞經(jīng)濟性。細(xì)胞的經(jīng)濟性可以以生成細(xì)胞的質(zhì)量與消耗底物的質(zhì)量之比值——細(xì)胞經(jīng)濟系數(shù)來衡量。第27頁/共36頁2023/4/52819.正常代謝和競爭型細(xì)胞經(jīng)濟

微生物在生存競爭中進(jìn)化的方向是發(fā)展其自身的適應(yīng)能力和提高細(xì)胞運行的經(jīng)濟系數(shù)。經(jīng)生存競爭而幸存下來的野生型微生物在其所棲身的環(huán)境中是富有競爭能力的，并且它們的代謝中間物在代謝網(wǎng)絡(luò)中的分布及細(xì)胞經(jīng)濟運行狀況有利于細(xì)胞生長、繁殖和在競爭中獲勝。在上述條件下，細(xì)胞處于正常代謝狀態(tài)，細(xì)胞經(jīng)濟體系呈現(xiàn)競爭型細(xì)胞經(jīng)濟的特色。第28頁/共36頁2023/4/52920.異常代謝和導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟

如果工業(yè)生產(chǎn)要求微生物在胞外累積某種代謝中間產(chǎn)物，則必須對微生物的代謝流進(jìn)行導(dǎo)向。根據(jù)已獲得的代謝分析的信息，應(yīng)用“五字策略”有可能設(shè)計理想載流途徑和配套的發(fā)酵培養(yǎng)工藝路線和工藝條件，進(jìn)而改造菌種、調(diào)整工藝，將代謝主流導(dǎo)向理想載流途徑。在導(dǎo)向成功的情況下，細(xì)胞處于異常代謝狀態(tài)，細(xì)胞經(jīng)濟體系呈現(xiàn)導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟的特色。第29頁/共36頁2023/4/53021.細(xì)胞經(jīng)濟受到嚴(yán)格的制約

工業(yè)發(fā)酵依靠細(xì)胞群體的代謝來獲得產(chǎn)品，導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟固然有利于特定的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，但競爭型細(xì)胞經(jīng)濟向?qū)蛐图?xì)胞經(jīng)濟的轉(zhuǎn)化受到能量代謝、還原力的平衡等條件的嚴(yán)格制約(以保證有熵的輸出)，表現(xiàn)出代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性。若細(xì)胞經(jīng)濟實體的運行狀態(tài)過度偏離競爭型運行狀態(tài)，活細(xì)胞的高度有序狀態(tài)將走向無序，最終導(dǎo)致細(xì)胞經(jīng)濟的崩潰。第30頁/共36頁2023/4/53122.信息流指導(dǎo)下的工業(yè)發(fā)酵

在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，可以把微生物細(xì)胞看作是細(xì)胞機器，它們進(jìn)行能量代謝和物質(zhì)代謝；同時又可以把它們看作是信息處理器，它們復(fù)制和傳遞自己的生物信息，接收細(xì)胞內(nèi)外的物理、化學(xué)甚至生物信息，并在對內(nèi)外信息流進(jìn)行綜合處理的基礎(chǔ)上，發(fā)出代謝調(diào)控的指令，在網(wǎng)絡(luò)剛性的范圍之內(nèi)控制微生物細(xì)胞自身的生命活動。第31頁/共36頁2023/4/53223.限制性遺傳信息之謎

可以推測在每個微生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中必有其限制性的生死攸關(guān)的遺傳信息，它們規(guī)定微生物細(xì)胞生命活動的基本的代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)節(jié)機制。這些遺傳信息是微生物細(xì)胞能夠自主生活與獨立存在的依據(jù)，也是微生物對環(huán)境的有限的適應(yīng)性以及設(shè)計育種的計劃往往不能完全兌現(xiàn)的內(nèi)在原因。第32頁/共36頁2023/4/53324.從發(fā)酵工程到代謝工程