微生物的遺傳變異和育種3

微生物的遺傳變異和育種3第1頁/共67頁第三節(jié)基因重組和雜交育種第2頁/共67頁

凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（generecombination）或遺傳重組（geneticrecombination），簡稱重組。第3頁/共67頁重組雜交（hybridization）遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交細胞水平

細胞水平的雜交包含分子水平上的重組。第4頁/共67頁第5頁/共67頁基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。在方向性還是自覺性方面，比誘變育種前進了一大步。且可消除某一菌株在經(jīng)過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。第6頁/共67頁一、原核生物的基因重組原核生物的基因重組形式很多，機制較原始。特點：①片段性，僅一小段DNA序列參與重組；②單向性，即從供體菌向受體菌（或從供體基因組向受體基因組）作單方向轉(zhuǎn)移；③轉(zhuǎn)移機制獨特而多樣，如接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等。第7頁/共67頁

受體菌（recipientcell，receptor）直接吸收供體菌（donorcell）的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱轉(zhuǎn)化子（transformant）。（一）轉(zhuǎn)化（transformation）

1.

定義第8頁/共67頁自然遺傳轉(zhuǎn)化（naturalgenetictransformation）人工轉(zhuǎn)化（artificialtransformation）第9頁/共67頁原核生物Streptococcuspneumoniae（肺炎鏈球菌）、Haemophilus（嗜血桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、Neisseria（奈瑟氏球菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Xanthomonas（黃單胞菌屬）等。2.

轉(zhuǎn)化微生物的種類第10頁/共67頁真核微生物Saccharomycescerevisiae（釀酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脈孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。第11頁/共67頁3.

感受態(tài)（competence）

感受態(tài)是指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，能發(fā)生轉(zhuǎn)化的受體細胞都處于感受態(tài)。感受態(tài)細胞（competentcell）具有攝取外源DNA能力的細胞。第12頁/共67頁自然感受態(tài)是細胞一定生長階段的生理特性，受細菌自身的基因控制；人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細胞內(nèi)。（該過程與細菌自身的遺傳控制無關(guān)?。┑?3頁/共67頁感受態(tài)受遺傳控制，但也存在個體差異。感受態(tài)出現(xiàn)的時間不同；感受態(tài)細胞所占比例和維持時間不同；外界環(huán)境因子如腺苷酸（cAMP）及Ca2＋等對感受態(tài)也有重要影響。第14頁/共67頁調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白稱感受態(tài)因子。膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白（membrane-associatedDNAbindingprotein）細胞壁自溶素（autolysin）幾個核酸酶第15頁/共67頁4.

轉(zhuǎn)化因子（transformingprinciple）轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是離體的DNA片段。一般只有15kb左右。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同。良好的轉(zhuǎn)化因子有dsDNA（最宜于細胞表面結(jié)合）、ssDNA和質(zhì)粒DNA，通常不能與核染色體組發(fā)生重組。第16頁/共67頁轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.1％～1.0％，最高為20％。能發(fā)生轉(zhuǎn)化的最低DNA濃度極低，為化學(xué)方法無法測出的1×10－5mg／mL（即1×10－11g／mL）。第17頁/共67頁

5.

轉(zhuǎn)化過程（1）自然遺傳轉(zhuǎn)化（簡稱自然轉(zhuǎn)化）1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化過程研究得較深入的就是這種G＋細菌。第18頁/共67頁目前已知有二十多個種的細菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力進行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：①建立了感受態(tài)的受體細胞②外源游離DNA分子第19頁/共67頁枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化過程（革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化模型）第20頁/共67頁strR，存在抗鏈霉素的基因標(biāo)記strS，有鏈霉素敏感型基因標(biāo)記第21頁/共67頁自然轉(zhuǎn)化過程的特點：a）對核酸酶敏感；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）供體菌和受體菌之間的親源關(guān)系；d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多；b）不需要活的DNA供體細胞；第22頁/共67頁提高質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率的二種方法：1）使質(zhì)粒形成多聚體，這樣進入細胞后重新組合成有活性的質(zhì)粒的幾率大大提高；2）在質(zhì)粒上插入受體菌染色體的部分片段，或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化進含有與該質(zhì)粒具有同源區(qū)段的質(zhì)粒的受體菌——重組獲救。第23頁/共67頁（2）人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。不是由細菌自身的基因所控制；用多種不同的技術(shù)處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高；第24頁/共67頁

指用提純的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主細胞或其原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。6.

轉(zhuǎn)染（transfection）第25頁/共67頁噬菌體DNA被感受態(tài)細胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆?，F(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進入細胞并表達后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。特點：第26頁/共67頁轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化把重組噬菌體或重組病毒DNA引入受體細胞以質(zhì)粒為載體的重組DNA分子引入受體細胞第27頁/共67頁（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）

通過缺陷噬菌體（defectivephage）的媒介，把供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細胞，就稱轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。第28頁/共67頁由噬菌體介導(dǎo)的細菌細胞間進行遺傳交換的一種方式：一個細胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個細胞中能將一個細菌的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個細菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。第29頁/共67頁細菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)第30頁/共67頁1.普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）

通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌任何小片段DNA進行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。一般用溫和噬菌體作為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介。第31頁/共67頁（1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)簡稱普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)或完全轉(zhuǎn)導(dǎo)（completetransduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)嗜菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源DNA在其內(nèi)進行交換、整合和復(fù)制，使其成為一個遺傳性狀穩(wěn)定的重組體，稱作普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子，這種現(xiàn)象就稱普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。第32頁/共67頁Salmonellatyphimurium（鼠傷寒沙門氏菌）的野生菌株Salmonellatyphimurium（鼠傷寒沙門氏菌）的營養(yǎng)缺陷型突變株P(guān)22嗜菌體供體菌受體菌第33頁/共67頁轉(zhuǎn)導(dǎo)模型供體菌受體菌轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介—嗜菌體誤包轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子雙交換同源配對10-6～10-8第34頁/共67頁第35頁/共67頁S.typhimurium的P22噬菌體、E.coli的P1噬菌體、Bacillussubtilis的PBS1和SP10等噬菌體都能進行完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。供體菌轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介——嗜菌體受體菌第36頁/共67頁（2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)簡稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)嗜菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源DNA在其內(nèi)既不進行交換、整合和復(fù)制，也不迅速消失，而僅進行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達，這種現(xiàn)象就稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。第37頁/共67頁受體菌外源DNA細胞分裂外源基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯而形成的少量酶獲得外源DNA獲得少量酶不斷稀釋第38頁/共67頁特點：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個細胞含有DNA，而其它細胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。第39頁/共67頁普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：進入受體的外源DNA通過與細胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進行重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達。特點：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個細胞含有DNA，而其它細胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。第40頁/共67頁2.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction，restrictedtransduction）指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。最初于1954年在E.coliK12中發(fā)現(xiàn)。第41頁/共67頁特點：①只局限于傳遞供體菌核染色體上的個別特定基因，一般為噬菌體整合位點兩側(cè)的基因；②該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；③缺陷噬菌體的形成方式是由于它在脫離宿主染色體過程中，發(fā)生低頻率（～10-5）“誤切”（不正常切離，abnormalexcesion）或由于雙重溶源菌的裂解而形成；④

局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過UV等因素對溶源菌的誘導(dǎo)并引起裂解后才產(chǎn)生。第42頁/共67頁局限轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子出現(xiàn)頻率的高低分類第43頁/共67頁溫和噬菌體感染整合到細菌染色體的特定位點上宿主細胞發(fā)生溶源化溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中第44頁/共67頁缺陷噬菌體在宿主細胞內(nèi)能夠象正常的λDNA分子一樣進行復(fù)制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細胞后，通過DNA整合進宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。E.coli的λ嗜菌體和φ80嗜菌體具有局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。第45頁/共67頁3.溶源轉(zhuǎn)變（lysogenicconversion）正常的溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時，因噬菌體的基因整合到宿主核基因組上，而使宿主獲得了除免疫性外的新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉(zhuǎn)變。一個與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象第46頁/共67頁溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同？a）這是一種不攜帶任何外源基因的正常時菌體；b）是嗜菌體的基因而不是供體菌的基因提供了宿主的新性狀；c）新性狀是宿主細胞溶源化時的表型，而不是經(jīng)遺傳重組形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子；d）獲得的性狀可隨嗜菌體的消失而同時消失；第47頁/共67頁（三）接合（conjugation，mating）

供體菌（“雄性”）通過性菌毛與受體菌（“雌性”）直接接觸，把F質(zhì)粒或其攜帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細胞，就是接合子（conjugant）。第48頁/共67頁1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗通過細胞與細胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程第49頁/共67頁第50頁/共67頁中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！第51頁/共67頁大腸桿菌的接合機制接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)F因子的分子量通常為5×107，上面有編碼細菌產(chǎn)生性菌毛（sexpili）及控制接合過程進行的20多個基因。含有F因子的細胞：“雄性”菌株（F+），其細胞表面有性菌毛不含F(xiàn)因子的細胞：“雌性”菌株（F-），細胞表面沒有性菌毛第52頁/共67頁F因子為附加體質(zhì)?？擅撾x染色體在細胞內(nèi)獨立存在，可插入（整合）到染色體上第53頁/共67頁F因子的四種細胞形式a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細胞表面同樣有性菌毛。第54頁/共67頁（四）原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）

通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體進行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定的重組子的過程，稱為原生質(zhì)體融合。由此法獲得的重組子，成為融合子（fusant）。第55頁/共67頁選擇兩個有特殊價值的并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細胞作為親本脫壁酶細菌或放線菌可用溶菌酶或青霉素處理，真菌可用蝸牛酶或其他相應(yīng)的脫壁酶等離心聚集在高滲溶液中稀釋加入促融合劑或電脈沖各種選擇性培養(yǎng)基原生質(zhì)體融合的主要步驟是：第56頁/共67頁原生質(zhì)體融合的重組頻率已大于10-1（而誘變育種一般僅為10-6）；同種的不同菌株間或種間進行融合，屬間、科間甚至更遠緣的微生物或高等生物細胞間的融合，以期達到生產(chǎn)性狀更為優(yōu)良的新物種。第57頁/共67頁二、真核微生物的基因重組有性雜交準(zhǔn)性雜交原生質(zhì)體融合遺傳轉(zhuǎn)化第58頁/共67頁（一）有性雜交（se