基因操作的技術(shù)原理電泳

基因操作的技術(shù)原理電泳第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四4.1核酸的凝膠電泳

1定義：用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。

瓊脂糖凝膠電泳適用于分離大分子核酸。聚丙烯酰胺凝膠電泳普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子質(zhì)量的核酸第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四2基本原理

帶有負(fù)電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將核酸分子混合物中的各種成分彼此分開。

第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四3電泳的遷移率電泳遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型

1分子量小的DNA分子>分子量大的DNA分子

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。2同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子

共價閉環(huán)>線性

>松散型的開環(huán)

相同分子量的質(zhì)粒其線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的。

第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四4凝膠電泳的分辨力

與凝膠的類型和濃度相關(guān)

瓊脂糖凝膠的分辨力在0.1～60Kb之間;

聚丙烯酰胺的分辨力在1bp～1Kb之間

凝膠濃度越大相對分離的DNA片段越小凝膠濃度越小相對分離的DNA片段越大第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四

瓊脂糖是一種從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取出的線性多糖聚合物。一瓊脂糖凝膠電泳包括：常熔點(diǎn)的瓊脂糖低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖

第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四LMP瓊脂糖性質(zhì)：熔點(diǎn)：62～65℃

在37℃

可保持液態(tài)數(shù)小時；在25℃

可保持液態(tài)約10分鐘

用途：回收DNA分子在65℃下將LMP瓊脂糖凝膠熔化；加入過量的酚抽提DNA；離心獲得含DNA分子的上清液；特點(diǎn)：直接酶切；價格昂貴第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四1瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)：

（1）緩沖液（2）凝膠的濃度

（3）加DNA樣品：<1μg，載樣緩沖液(溴酚藍(lán)，甘油）

（4）電泳條件

（5）染色和觀察

第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（1）緩沖液：

常用的幾種電泳緩沖液有：

TAE[Tris-乙酸和EDTA(pH8.0)]TBE(Tris-硼酸和EDTA)TPE(Tris-磷酸和EDTA)

一般配制成濃縮母液（10X或5X）,儲于室溫。第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四TAE、TBE和TPE比較Buffer緩沖容量遷移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度復(fù)雜DNA混合物；超螺旋DNATBE很高較慢低分子量高價格昂貴，不常用TPE第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（2）瓊脂糖濃度與DNA分子大小的關(guān)系DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。

分離的DNA片段＜0.5kb

所需膠濃度是1.2-1.5%,

分離的DNA片段＞10kb

所需膠濃度為0.3-0.7%,

DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（4）電泳條件

在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加,不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。

大片斷低電壓長時間小片段高電壓短時間第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（5）染色和觀察：

溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色，

溴化乙錠用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng)。

1常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性，致癌作用。

2SYBR

Green，GelRed毒性小，但價格貴。

3GeneGreen相比則是性價比高的低毒替代染料，其靈敏度比傳統(tǒng)EB染料高10

倍以上。溴化乙錠染料分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四

用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對DNA片斷大小的估算

第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖凝膠電泳的操作步驟

1.

根據(jù)欲分離DNA片段大小用配制適宜濃度瓊脂糖溶液：應(yīng)準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉加到盛有定好量的電泳緩沖液的三角燒瓶或玻璃瓶中。緩沖液體積應(yīng)小于容器容積的50%。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。2待熔化的凝膠稍冷卻后加入溴化乙錠（槍頭沾取少許即可）。輕輕地旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液。3.

瓊脂糖溶液正在冷卻時，用一個合適的梳子形成加樣孔。梳齒的位置在托盤底面上0.5～1.0mm，這樣瓊脂糖澆灌到托盤時將形成符合要求的加樣孔。4.

澆灌溫?zé)岬沫傊侨芤哼M(jìn)入模具。凝膠適宜厚度為3～5mm。5.

讓凝膠溶液完全凝結(jié)，室溫下20-30min。小心拔出梳子。將凝膠安放到電泳槽內(nèi)。向電泳槽加入電泳緩沖液。第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四6.

混合DNA樣品和0.2倍體積6×指示劑。7.

用微量移液器將樣品混合液緩慢加至浸沒凝膠的加樣孔內(nèi)。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)分別加至樣品孔的左側(cè)和右側(cè)的兩個孔內(nèi)。8.

關(guān)上電泳槽蓋，接好電極插頭。給予合適的電壓。9.

當(dāng)DNA樣品或染料在凝膠中遷移了足夠距離時，關(guān)上電源、拔出電極插頭和打開電泳槽蓋.10.轉(zhuǎn)移凝膠至凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察。/v/b/76004310-1602802407.html第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四二聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法

PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點(diǎn)等

第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四蛋白分子量與聚丙烯酰胺凝膠濃度對應(yīng)關(guān)系第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四

SDS電泳凝膠中各主要成分的作用

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺是為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇Tris-HCL系統(tǒng)。

TEMED與AP(催化劑)：促凝作