基因工程基本操作過程目的基因與運(yùn)載體結(jié)合

基因工程基本操作過程目的基因與運(yùn)載體結(jié)合第1頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四基因工程（geneticengineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段?；蚬こ桃兀喊ㄍ庠碊NA，載體分子，工具酶和受體細(xì)胞等第2頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四1.提取目的基因2.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）是基因工程的核心。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)切、接、轉(zhuǎn)、增、檢重組DNA技術(shù)的操作步驟：第3頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四第4頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四

外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴于限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用.

基因重組:就是利用限制性內(nèi)切酶及其他一些酶類，切割和修飾載體DNA和目的基因．將兩者連接起來，將目的基因插入于可以自我復(fù)制的載體內(nèi)，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，以這種外源性的目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)得到擴(kuò)增或正確表達(dá)。第5頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四依不同的研究目的而定，認(rèn)真設(shè)計(jì)最終構(gòu)建的重組體分子。需要考慮下列2個(gè)方面。如果研究目的是：(1)表達(dá)有價(jià)值的蛋白質(zhì)，要考慮選用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)序列和終止序列，要將目的基因置于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游，并審視“閱讀框”是否正確，這些對(duì)表達(dá)融合蛋白至關(guān)重要。(2)對(duì)某一基因的上游序列進(jìn)行調(diào)控機(jī)能分析，則需考慮選擇適當(dāng)?shù)膱?bào)告基因，并將可能具有調(diào)控機(jī)能的目的基因置于報(bào)告基因的上游適當(dāng)位置。若調(diào)控基因可能有增強(qiáng)子作用，還應(yīng)在報(bào)告基因下游適當(dāng)部位插入一個(gè)功能基因，由此反映增強(qiáng)子的作用。一、連接前的準(zhǔn)備第6頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四第7頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四為了將目的基因重組于載體分子之中，需要將載體DNA和目的基因分別進(jìn)行適當(dāng)處理，使其可以互相連接，形成新的重組分子。二、連接前的處理第8頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四載體DNA通常有著許多酶切位點(diǎn)．但是并不是所有的酶切位點(diǎn)都可用于重組切割，理想的酶切位點(diǎn)應(yīng)該符合下列幾個(gè)條件:1）位于載體上特定的酶切位點(diǎn)要盡可能少,最好是單一酶切位點(diǎn),這樣才能保證目的基因和載體DNA以最高的幾率正確組合.2）

在酶切位點(diǎn)之前要有一個(gè)較強(qiáng)的啟動(dòng)子，使插入的目的基因可在該啟動(dòng)子的指導(dǎo)下高效表達(dá)。3）選擇的載體必須在連接后對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的編碼區(qū)讀框不改變。1.對(duì)載體的要求第9頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四當(dāng)載體和外源DNA用同樣的限制性內(nèi)切酶切割時(shí)，所形成的DNA末端就能夠彼此相匹配，可以被T4連接酶共價(jià)地連接起來，形成重組體分子。但是,當(dāng)靶片段的末端與載體不匹配時(shí)，必須轉(zhuǎn)換其中一個(gè)或兩個(gè)片段的末端形式以便使之連接。這種末端的轉(zhuǎn)換通常用以下三種方式轉(zhuǎn)換：①

3’凹端補(bǔ)平：使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平3’凹端，將不匹配的3‘凹端轉(zhuǎn)換為粘端；或者完全補(bǔ)平，產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA相連接。

②3’突端切除：T4噬菌體DNA聚合酶具有強(qiáng)烈的3’-5’外切核酸酶活性，可將3’突端切除。

③平端加上人工合成接頭：合成接頭是自相互補(bǔ)的兩個(gè)化學(xué)合成的寡核苷酸的等摩爾混合物，而兩個(gè)寡聚體可形成帶一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的平端雙鏈體。因此在平端DNA加接頭可為其亞克隆操作增加一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。2、連接前的處理：末端的轉(zhuǎn)換第10頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四載體DNA和目的基因DNA的連接,按DNA片段末端性質(zhì)不同，可有下述不同的連接方法：①粘性末端連接法

②平端連接法③同聚物加尾連接法④人工接頭連接法三．基因與載體的連接4種方法第11頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四1.同一限制酶切位點(diǎn)連接:由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端和酶切位點(diǎn)附近的DNA序列不影響連接.在連接酶的作用下即可形成重組DNA分子.

上述方法的缺點(diǎn)：由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)中常發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。解決方法：用細(xì)菌的堿性磷酸酶預(yù)先處理線性的載體DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。（一）粘性末端DNA片段的連接

第12頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四第13頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四2.不同限制酶切位點(diǎn)連接:由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段、具有相同類型的粘性末端，彼此稱為互補(bǔ)末端也可以采用粘性末端連接。外源DNA和載體DNA經(jīng)過兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割后一側(cè)產(chǎn)生的黏性末端，另一側(cè)產(chǎn)生平未端（可先生成黏性末端再補(bǔ)平）。第14頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點(diǎn)外源DNA只能以一個(gè)方向定向插入到重組質(zhì)粒中，以便目的基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。載體與外源DNA結(jié)合處的限制酶切位點(diǎn)仍然保留，可以隨時(shí)從重組載體中通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割后分離獲得目的基因。不會(huì)自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌克隆大多數(shù)攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒。第16頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四

一些內(nèi)切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割產(chǎn)生DNA的片段沒有粘性末端，而是平末端。具有平末端的酶切載體只能與平末端的目的基因連接。T4DNA連接酶可催化相同或不相同的限制性內(nèi)切酶切割的平端間的連接。平端連接比粘性末端連接要困難的多，其連接效率很低，約有粘性末端連接的1%。適用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端適用于粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端

（二）平端連接第17頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四提高平頭末端連接效率的方法包括：

①加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）②加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)；③加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用；④加入單價(jià)陽離子（NaCl）。第19頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四

當(dāng)載體和外源DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)之間，不可能找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r(shí)，解決方法：

⑴人工接頭連接法：通過依次加入、連接合成DNA接頭，再用限制酶切加以解決。

⑵同聚物加尾連接法：可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體酶切位點(diǎn)處和外源DNA片段的3’端加上相互補(bǔ)的同聚尾加以解決。⑶PCR法：通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)擴(kuò)增外源DNA片段，從而加上合適的限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別序列，再用限制酶切加以解決。第20頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四同聚物加尾連接：利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸。dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下,連接成為重組的DNA。這種方法可適用于任何來源的DNA片段。但方法較繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用。（三）同聚物加尾法第21頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四第22頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四同聚物接尾法實(shí)際上是一種人工粘性末端連接法。優(yōu)點(diǎn)：通過DNA加尾，既可以使兩個(gè)具平末端的DNA片段進(jìn)行連接，也可以使具平末端的DNA片段與粘性末端的DNA片段進(jìn)行連接。

缺點(diǎn)：只對(duì)質(zhì)粒載體有效；質(zhì)粒和cDNA上的同聚物長(zhǎng)度難以控制相等，影響克隆效率；用其轉(zhuǎn)化宿主菌的效率依不同菌株而有較大差異。第23頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四人工接頭（DNA寡核苷酸連桿）是人工合成的具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙股平端DNA短序列。由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。（四）人工接頭連接法第24頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四第25頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點(diǎn)：是進(jìn)行DNA重組的一種既有效又實(shí)用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端連接法的優(yōu)點(diǎn)，而且它可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求，設(shè)計(jì)出具有不同限制酶位點(diǎn)的人工接頭。若在體外連接反應(yīng)中增加人工接頭的濃度，還會(huì)大大提高平末端DNA片段間的連接效率。缺點(diǎn)：如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的人工接頭相同的限制酶切位點(diǎn)，這樣在酶切消化人工接頭產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的外源基因切成不同的片段，從而為后繼的操作造成麻煩。第26頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四自從1973年Jackson等人在一次分子生物學(xué)學(xué)會(huì)上首次提出基因可以人工重組，并能在細(xì)菌中復(fù)制。從此以后，基因工程成為一項(xiàng)新興的研究領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展，無論是基礎(chǔ)研究，還是應(yīng)用研究均取得了喜人的成果。這是生命科學(xué)發(fā)展的一次飛躍，生命科學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)定向、快速改造生物性狀的新時(shí)代，受到了國內(nèi)外廣泛的重視。開展基因工程研究幾十年來，建立了多種分別適用于微生物、動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的載體受體系統(tǒng)，克隆出了一批有用的目的基因，研制出了數(shù)十種昂貴的基因工程藥物，培育出了一批具有特殊性狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物?；蚬こ坛晒旱?7頁，共29頁，2023年，2月20日，星期四基因工程在20世紀(jì)取得了很大的進(jìn)展，至少有兩個(gè)有力的證明。一是轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物，一是克隆技術(shù)。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物由于植入了新的基因，使得動(dòng)植物具有了原先沒有的全新的性狀，這引起了一