(4)-9.3重組基因的導(dǎo)入與重組子的鑒定

宿主細胞：

原核細胞(大腸桿菌)

真核細胞(哺乳類動物細胞、酵母和昆蟲細胞)

重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞方式：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染轉(zhuǎn)：重組DNA導(dǎo)入宿主細胞將重組的DNA分子導(dǎo)入細菌，使其在細菌體內(nèi)擴增及表達的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)

轉(zhuǎn)化的方法可分為CaCl2法和電擊法

感受態(tài)細胞用特殊方法處理后，受體細胞才具備接受外源DNA的能力，這種細胞稱感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞有原核細胞和真核細胞兩大類。一、重組DNA分子導(dǎo)入原核細胞CaCl2法當細菌處于0℃、二價陽離子低滲溶液中時，細菌細胞膨脹成球形，處于感受態(tài);

轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細胞表面，在42℃短時間熱沖擊后DNA進入細胞轉(zhuǎn)化效率為每微克DNA可獲得105~106轉(zhuǎn)化子CaCl2法電擊法（electroporation）即電擊法，利用高壓脈沖，在細菌細胞表面形成暫時性的微孔，重組DNA從微孔中進入，脈沖過后微孔復(fù)原轉(zhuǎn)化效率高，每微克DNA可得到109~1010轉(zhuǎn)化子電擊法使用噬菌體或病毒將重組DNA分子導(dǎo)入細胞重組DNA分子在體外包裝成具有感染能力的噬菌體或病毒顆粒，然后感染適當?shù)募毎?，這種使用噬菌體或病毒將重組DNA分子導(dǎo)入細胞的方法為感染(infection)。效率較高，每微克可得到107轉(zhuǎn)化子。

二、重組DNA分子直接導(dǎo)入真核細胞

將外源DNA直接導(dǎo)入真核細胞的過程稱為轉(zhuǎn)染（transinfection）常用的方法：聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法：PEG6000

磷酸鈣DNA共沉淀法

脂質(zhì)體法

DEAE-葡聚糖介導(dǎo)

顯微注射法等轉(zhuǎn)染方法化學(xué)轉(zhuǎn)染法物理轉(zhuǎn)染法病毒感染法DEAE一葡聚糖法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒磷酸鈣法電穿孔法腺病毒人工脂質(zhì)體法基因槍法基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法

是最早應(yīng)用哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽離子多聚體,它與帶負電的核酸結(jié)合后接近細胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時開始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。DEAE-葡聚糖法磷酸鈣共沉淀法先將DNA和CaCl2混合，然后加入PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，沉淀顆粒附著在細胞表面，在鈣、磷的誘導(dǎo)下通過內(nèi)吞作用被細胞攝取。脂質(zhì)體是一種人造膜泡，它帶有正電荷，與DNA或RNA上帶負電的磷酸基團結(jié)合，形成由陽離子脂質(zhì)包裹DNA的顆粒。脂質(zhì)體上剩余的正電荷與細胞膜上的唾液酸殘基的負電荷結(jié)合，通過二者的融合將外源基因?qū)爰毎?。脂質(zhì)體法（目前應(yīng)用最廣泛）物理方法(電穿孔、顯微注射及基因槍)（1）電穿孔法利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細胞，重現(xiàn)性好，但需要較多的細胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強度和持續(xù)時間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細胞的最佳平衡點。（2）顯微注射法將外源基因的重組體通過顯微注射裝置直接注入細胞核中并進行表達，但顯微注射法需要一定的儀器和操作技巧。顯微注射顯微操作儀器（3）基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細胞和在體的細胞。（一）遺傳標記物的鑒定（二）PCR鑒定（三）酶切鑒定（四）測序鑒定重組子的鑒定篩：篩選出含有重組體的受體細胞（一）遺傳標記物的鑒定

1.抗性標記篩選

2.抗性標志插入失活篩選3.α-互補篩選

4.標志補救篩選1.抗性標志篩選（平板篩選）

當帶有完整抗藥性基因的載體轉(zhuǎn)入無抗藥性細胞后，凡轉(zhuǎn)入載體的細胞都獲得了抗藥性，能在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長成菌落，而未被轉(zhuǎn)化的宿主細胞不能生長。選用含有兩個以上的抗藥基因載體，外源DNA片段插入其中一個基因，導(dǎo)致這個基因失活，用兩個含不同抗生素的平板互相對照，篩選含重組DNA的菌落。2.抗性標志插入失活篩選抗性標志插入失活篩選3.α互補篩選（藍白斑篩選）載體含有一個來自于大腸桿菌的經(jīng)過加工的LacZ基因（LacZ’），它編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的α-肽段（N端），可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大腸桿菌（只表達該酶的ω肽段-酶的C端)實現(xiàn)基因內(nèi)互補，即α-互補，產(chǎn)生具有活性的β-半乳糖苷酶，恢復(fù)分解乳糖的能力，從而使宿主細菌在含有IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上呈藍色。無質(zhì)粒的宿主菌β半乳糖苷酶部分缺失，不能分解X-gal；無抗生素抗性在含有抗生素和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌落質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌α互補后，β半乳糖苷酶表達，分解X-gal；有抗生素抗性在含有抗生素和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)藍色菌落帶外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌插入失活，無法形成β半乳糖苷酶，無法分解X-gal；有抗生素抗性在含有抗生素和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)白色菌落

藍－白篩選示意圖抽提少量重組DNA↓PCR擴增↓電泳鑒定↓序列分析2000bp1000bp

3211：DL2000；2：pVAX1/gB680；3：pVAX1/pp65m；（二）PCR鑒定

經(jīng)過粗篩后的含重組體的細菌，還需進行限制酶譜分析進一步鑒定。將單一細菌進行擴增后分別提取其DNA，用重組時所用的同一限制酶進行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。（三）酶切鑒定重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的酶切鑒定screeningrecombinanttransfervectorbyXho

IandHindⅢ

lanel:DL2000Marker；lane2-4：recombinanttransf