H4受體介導組胺刺激AtT

H4受體介導組胺刺激 AtT作者：孟嘉，謝建軍，楊鐵虹，王海芳，李明凱，胡靜 ,羅曉星【關(guān)鍵詞】組胺【Abstract】AIM:Toclarifythesubtypeofhistamine(HA)receptorwhichmediatesAdrenocorticotropicHormone(ACTH)releasefrommouseanteriorpituitarytumorcelllineAtT20.METHODS:ELISAassaywasusedtodeterminetheeffectsofavarietyofhistaminereceptorsubtypespecificagonistsandantagonistsonACTHreleasefromAtT20cells.TheexpressionofH4receptormRNAonAtT20cellswasdetectedbyRTPCRandthePCRproductwassequenced.RESULTS:①HA(108mol/L)significantlyacceleratedthereleaseofACTH(pmol/L)fromAtT20cells（±vs±incontrol,P<）.ThehistamineH1receptorspecificantagonistChlorpheniramine(±)andhistamineH2receptorspecificantagonistRanitidine(±)didnotinhibittheeffectofHA.②ThesameasHA,histamineH3andH4receptoragonistR(α)Methylhistamine(10-7mol/L)increasedthereleaseofACTHfromAtT20cells（±）.③H4receptorspecificantagonistJNJ777120(1［(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl］4methylpiperazine)demonstratedaconcentrationdependentinhibitoryeffectontheincreasingACTHsecretioninducedbyHA,andtheeffectofHAwastotallyabolishedbyJNJ777120at10-5mol/L.④RTPCRconfirmedthatAtT20cellspresentedanendogenousexpressionofH4receptormRNA.CONCLUSION:HAstimulatesthereleaseofACTHfromAtT20cellsthroughH4receptormediation.Keywords】histamine;receptors,histamineH4;AtT20cell;corticotropin【摘要】 目的：闡明介導小鼠垂體前葉瘤細胞株 (AtT20)分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的組胺（HA）受體亞型. 方法：體外培養(yǎng)AtT20細胞，ELISA檢測各

HA受體亞型的激動劑和拮抗劑對

AtT20細胞分泌

ACTH的影響；利用RTPCR方法檢測AtT20細胞中H4受體mRNA的表達.結(jié)果：①HA（10-8mol/L）作用于AtT20細胞6h，ACTH分泌量（pmol/L）增加（±）,與對照組相比（±）有顯著差異（P<）；而組胺H1受體特異性拮抗劑撲爾敏(±)和H2受體特異性拮抗劑雷尼替丁(±)不能拮抗此效應(yīng).②HAH3和H4受體激動劑R(α)甲基組胺（10-7mol/L）同HA作用相似，能夠促進 AtT20細胞分泌ACTH（±）.③HAH4受體的特異拮抗劑

JNJ777120(1［(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl

］4methylpiperazine)

能夠劑量依賴性拮抗

HA促進

AtT20細胞釋放

ACTH的效應(yīng)，當濃度為10-5mol/L 時，HA的效應(yīng)被完全阻斷細胞中存在組胺 H4受體mRNA的內(nèi)源性表達.

.

④RTPCR結(jié)果證實，在AtT20結(jié)論：HA調(diào)控AtT20細胞分泌ACTH的作用由H4受體介導.【關(guān)鍵詞】 組胺；受體，組胺

H4；AtT20

細胞；促腎上腺皮質(zhì)激素0引言組胺(histamine, HA)是生物體內(nèi)具有功能活性的一種重要物質(zhì)， 通過不同的HA受體調(diào)節(jié)多種生理功能.HA能夠調(diào)節(jié)垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)，該效應(yīng)被認為是由 H3受體介導的［1］.但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)［ 2］，這一結(jié)論還存在一些無法解釋的疑點 .20XX年H4受體首次被發(fā)現(xiàn)［3］，隨著對其研究的深入［4］，許多研究結(jié)果提示 HA調(diào)節(jié)ACTH釋放的效應(yīng)極有可能是由 H4受體介導的，而并非H3受體. 本研究采用能夠特異性分泌ACTH的小鼠垂體前葉瘤細胞系（AtT20）為模型，觀察ACTH的釋放是否由HAH4受體調(diào)節(jié)，以明確HA促進ACTH分泌的機制，為深入研究HA的免疫調(diào)節(jié)作用提供新的線索，并可為臨床治療異位ACTH綜合征提供新的思路.材料和方法材料AtT20細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所（從美國 ATCC引進，編號：CRL1795）；DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Gbico公司；新生牛血清購自杭州四季青生物材料研究所；L谷氨酸、組胺、雷尼替丁、撲爾敏及R(α)甲基組胺購自美國Sigma公司；ACTH檢測試劑盒購自美國Market公司；JNJ777120(1［(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl］4methylpiperazine，JNJ)由美國強生公司RobinL.Thurmond博士饋贈；Trizol,反轉(zhuǎn)錄酶(SuperScriptⅢ)購自美國Invitrogen公司；Taq酶購自日本Takara公司；Balb/c小鼠由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供.方法細胞培養(yǎng)將AtT20細胞株,接種于含100mL/L新生牛血清，4mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于950mL/LO2,50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)，以后每2~3d以g/L胰酶消化后按1∶3傳代.所使用的細胞均為處于指數(shù)增長期，且在傳代20代以內(nèi)的細胞.受體激動劑和拮抗劑對 AtT20細胞分泌ACTH的影響將AtT20細胞以2×105個/孔的密度接種于24孔板，24h后換用不含血清的培養(yǎng)液，并按實驗分組設(shè)計加入不同濃度的各種HA受體激動劑及拮抗劑，6h后收集各孔上清液，離心去除脫落細胞，按照試劑盒操作步驟進行ELISA測定，根據(jù)標準曲線換算所含ACTH的濃度.實驗共分A~I9組，分別為A：基礎(chǔ)狀態(tài)；B：組胺(10-8mol/L)；C：HA（10-8mol/L）+撲爾敏(10-5mol/L)；D：HA（10-8mol/L）+雷尼替丁(10-5mol/L)；E：R(α)甲基組胺(10-7mol/L)；F：HA（10-8mol/L）+JNJ(10-8mol/L)；G：HA（10-8mol/L）+JNJ(10-7mol/L)；H：HA（10-8mol/L）+JNJ(10-6mol/L)；I：HA（10-8mol/L）+JNJ(10-5mol/L).每組各設(shè)一個復孔，每組試驗重復6次.檢測H4受體mRNA的表達用Trizol處理AtT20細胞和成年Balb/c小鼠的垂體，提取總RNA.小鼠中按H4受體在Genebank中的編號為gi:15420534，全長1538bp，擴增HAH4受體mRNA所用引物：上游引物5′ATGCGGAGTCTAACAGTACTGG3′，下游引物5′GAAGATACTGACTGGTTCT3′［8］.使用隨機引物反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)參照試劑盒說明進行操作；PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min，53℃

30s

，72℃

1min

，35個循環(huán)；72℃延伸

5min.

反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物行

10g/L

瓊脂糖凝膠電泳

,

以凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄電泳結(jié)果

,

回收并測序.統(tǒng)計學處理：

數(shù)據(jù)以

x±s表示，采用

SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析.P<認為差異有統(tǒng)計學意義.結(jié)果細胞培養(yǎng)對傳代l~8d后的細胞進行觀察，并用OLYPUS（IX71）倒置熒光生物顯微鏡拍照.細胞消化分散后呈小圓形，傳代ld后單個細胞呈梭形或三角形，體積較小，細胞中央隱約可見細小圓形顆粒；2~4d后細胞體積逐漸增大,單個細胞呈梭狀，島狀或楓葉狀，有的呈多角形或簇狀接合，部分體積較大的細胞開始融合，細胞中央顆粒明顯可見（圖1）；5~6d，大部分細胞融合緊密，有的已呈層疊生長，并出現(xiàn)細胞脫落，同時在大片融合細胞的邊緣可見新生出的梭狀小細胞；至8d細胞脫落明顯，個別區(qū)域呈大片脫落，原已融合成片的細胞層塊中央呈空穴狀.圖1光學顯微鏡下AtT20細胞形態(tài)×400（略）受體激動劑和拮抗劑對 AtT20細胞分泌ACTH的影響給與HA(10-8刺激6h后AtT20細胞的ACTH分泌量(±)pmol/L 較基礎(chǔ)狀態(tài)(±)pmol/L增加(P<)；而在給與HA的同時給與H1受體拮抗劑撲爾敏 (10-5 mol/L)

mol/L)顯著或H2受體拮抗劑雷尼替丁（10-5 mol/L），ACTH分泌量分別為(±)pmol/L 和(±)pmol/L，與HA組相比無明顯差異，即不能拮抗 HA的作用. 當給與H3受體和H4受體的激動劑R(α)甲基組胺（10-7mol/L），ACTH分泌量（±)pmol/L較基礎(chǔ)狀態(tài)顯著增加(P<）.HA促進ACTH釋放的效應(yīng)可為特異性 H4受體阻斷劑JNJ所拮抗，且具有明顯的劑量依賴性，當 JNJ濃度增至10-5mol/L時，ACTH的分泌量同基礎(chǔ)狀態(tài)相比無統(tǒng)計學差異， HA促進ACTH釋放的效應(yīng)被完全阻斷（圖 2）.A:基礎(chǔ)狀態(tài)； B:HA(10-8mol/L) ； F:HA(10-8mol/L)JNJ(10-8mol/L) ；G:HA(10-8mol/L) ＋JNJ(10-7mol/L) ； H:

＋HA(10-8mol/L) ＋JNJ(10-6mol/L) ；I:HA(10-8mol/L)mol/L). aP<vs基礎(chǔ)狀態(tài);bP<vsHA(10-8mol/L).

＋JNJ(10-5圖2H4受體特異性拮抗劑 JNJ對HA刺激AtT20細胞釋放ACTH的影響（略）受體mRNA的表達取AtT20細胞及正常Balb/c小鼠垂體RNA的RTPCR產(chǎn)物各5μL行10g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像，可見一大小為 1185bp特異性條帶，而陰性對照孔（以總 RNA為模板直接PCR）的相應(yīng)位置處未見條帶(圖3).將所得片段切膠回收送檢測序.將測序結(jié)果與Genebank中的小鼠HAH4受體序列（gi:15420534）BLAST對比完全吻合，說明AtT20細胞中以及小鼠垂體中均有HAH4受體mRNA的表達.M:DL20XXmarker; 1, 2:H4受體在AtT20細胞及小鼠垂體表達的 RTPCR產(chǎn)物;3,4:H4

受體在

AtT20細胞及小鼠垂體表達的陰性對照圖3AtT20

細胞中及小鼠垂體

HAH4受體

mRNA的表達（略）3討論H4受體為20XX年新發(fā)現(xiàn)的HA受體亞型，其氨基酸序列與 H1，H2受體同源性較低，而與 H3受體的同源性較高，在跨膜區(qū)其同源性高達 58%，這使得它們在藥理學特性上也存在交叉重疊現(xiàn)象 ［3］. 包括RAMHA及thioperamide 在內(nèi)的大多數(shù)H3受體的特異配體對 H4受體也有作用，只是親和力不同［ 5］. 本實驗結(jié)果顯示，

H1和

H2受體特異拮抗劑撲爾敏及雷尼替丁無法拮抗

HA促進AtT20細胞分泌ACTH的效應(yīng)；同時，HAH3,H4受體的激動劑RAMHA（10-7mol/L）可以模擬同等強度的HA(10-8mol/L)促進ACTH釋放效應(yīng)，這與H4受體的動力學特點相符；而HAH4受體的高選擇性特異拮抗劑JNJ［6］能夠特異性拮抗HA的作用，且有明確的劑量效應(yīng)關(guān)系；此外，在 AtT20細胞中檢測到內(nèi)源性 H4受體mRNA的表達. 以上研究結(jié)果表明 HA調(diào)控AtT20細胞分泌ACTH的作用是由H4受體介導的.HAH4受體主要分布在外周組織，高表達于與炎癥反應(yīng)相關(guān)的組織和造血細胞中，故目前對 H4受體的研究多集中于免疫和造血以及干細胞分化等方面的功能［7-9］.本研究表明H4受體介導HA刺激AtT20細胞分泌ACTH，同時亦在正常小鼠的垂體組織中檢測到H4受體mRNA的表達.小鼠與人的H4受體同源性高達69%［4］，提示HA刺激人垂體分泌ACTH的作用可能也由H4受體介導.ACTH在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)損傷后的恢復與再生及學習記憶等多種生理功能. 腦內(nèi)腫瘤或腦創(chuàng)傷時，常影響下丘腦功能，出現(xiàn)下丘腦垂體機能失調(diào)而使ACTH分泌相對不足.臨床研究證明腦腫瘤、腦外傷時提高血中ACTH的濃度，可明顯改善和恢復腦細胞的功能并緩解意識障礙、頭痛、嘔吐等癥狀.本研究證明了HAH4受體可以調(diào)控AtT20細胞分泌ACTH，為臨床腦腫瘤及腦外傷的治療及術(shù)前準備提供新的思路，為深入研究HA的免疫調(diào)節(jié)作用提供新的線索，并為臨床治療異位ACTH綜合征提供新思路.【參考文獻】［1］ClarkMA,KorteA,MyersJ,et al.HighaffinityhistamineH3receptors regulate ACTHrelease byAtT20cells ［J］.EurJPharmacol,1992,210:31-35.［2］謝建軍,羅曉星,趙德化.組胺H3受體對垂體瘤AtT20細胞分泌ACTH的調(diào)節(jié)作用［J］.第四軍醫(yī)大學學報,20XX,22:584-586.［3］OdaT,MorikawaN,SaitoY,etal.Molecularcloningandcharacterizationofnoveltypeofhistaminereceptorpreferentiallyexpressedinleukocytes［J］.JBiolChem,20XX,275:36781-36786.［4］LiuC,WilsonSJ,KueiC,eta1.Comparisonofhuman,mouse,rat,andguineapighistamineH4receptorsrevealssubstantialpharmacologicalspeciesvariation［J］.JPharmacolExpTher,20XX,299(1):121-130.［5］HoughLB.Genomicsmeetshistaminereceptor:newsubtypes,new