微生物細胞的破碎技術

微生物細胞的破碎技術第1頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四

胞外產品：各種胞外酶、胞外多糖、細胞代謝物細胞本身：單細胞蛋白（SCP）胞內產品:堿性磷酸酯酶，基因工程產物，植物細胞產物等1.微生物細胞的破碎技術概述第2頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四2.細胞壁的組成和破碎阻力細菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結構。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質，主要阻力來自于壁結構交聯(lián)的緊密程度和厚度。絲狀真菌：多糖，蛋白質，脂類，葡聚糖，幾丁質，主要阻力來自于壁強度和聚合物網(wǎng)狀結構。第3頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四第4頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四第5頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四第6頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四第7頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四各種微生物細胞壁的結構與組成

第8頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四3.微生物細胞的破碎技術

第9頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四高壓勻漿法高壓勻漿器采用高壓勻漿器是大規(guī)模破碎細胞的常用方法，利用高壓迫使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)造成細胞破裂第10頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四高壓勻漿法特點破碎率較高適合大規(guī)模細胞破碎碎片細小，胞內物質釋放完全適合格蘭氏陽性菌和酵母的破碎;不適合霉菌,因為容易造成堵塞;對革蘭氏陽性菌破碎效果較差第11頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四影響因素操作壓力（50～70MPa）細胞濃度（20％）溫度循環(huán)次數(shù)(2~5)第12頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四高壓勻漿器第13頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四珠磨法

珠磨法是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使達到細胞的某種程度破碎。這些裝置的主要缺點是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分解決。第15頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四高速珠磨機第16頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四珠磨法特點破碎率較高適合大規(guī)模細胞破碎碎片較小，胞內物質釋放完全溫度容易急劇上升，需要良好的降溫配套設備相對與酵母和細菌，珠磨法更適合真菌菌絲和藻類第17頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四影響細胞破碎的因素攪拌速度（700～1450r/min）料液的循環(huán)速度（50～500L/h）細胞濃度（0.3～0.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.45～1mm；70％～90％)第18頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四超聲波法細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質中的懸浮細胞上造成了剪切應力，促使細胞內液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。影響因素:功率、發(fā)射時間、次數(shù)、細胞懸浮液體積對于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處理的效果不同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細胞比革蘭氏陽性菌細胞容易破碎，對酵母菌的效果極差。該法不適于大規(guī)模操作，因為放大后，要輸入很高的能量來提供必要的冷卻，這是困難的。第19頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四電聲超聲波發(fā)生器第20頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四

化學法

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化學法采用化學法處理可以溶解細胞或抽提胞內組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機溶劑等化學試劑酸使蛋白質水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿和表面活性劑能溶解細胞壁上脂類物質或使某些組分從細胞內滲漏出來。常用表面活性劑有膽酸鹽、磷脂、SDS、CTAB、有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等

第22頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四化學法優(yōu)點：對產物的釋出選擇性好，細胞外形較完整，碎片少，核酸等胞內雜質釋放少，便于后步分離、不需要專門設備等優(yōu)點，故使用較多。缺點：易導致活性物質破壞、化學試劑的加入，常會給隨后產物的純化帶來困難總結：①酸堿容易造成產物水解或變性，慎用；②表面活性劑以及丁酯、丁醇、丙酮等有機溶劑適合于絕大部分非蛋白類的物質；

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酶解法利用酶反應，分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而達到破壁的目的。優(yōu)點：專一性強，發(fā)生酶解的條件溫和。缺點：酶水解費用較貴，一般只適用于小規(guī)模的實驗室研究。溶菌酶是應用最多的酶，它能專一地分解細胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中使細胞破裂。第24頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的介質中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，達到平衡后，介質被突然稀釋，或者將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內，引起細胞壁的破裂。滲透壓沖擊的方法僅對細胞壁較脆弱的菌，或者細胞壁預先用酶處理，或合成受抑制而強度減弱時才是合適的。第25頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四凍結-融化法將細胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復多次而達到破壁作用。對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低即使反復循環(huán)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質的變性。第26頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四干燥法可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等?？諝飧稍镏饕m用于酵母菌。真空干燥適用于細菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質。干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質或其它組織變性。第27頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四機械破碎法與非機械法比較

第28頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四4破碎方法的選擇細胞的量破碎條件——目標產物對破碎條件的敏感性破碎目標——待破碎細胞的機械強度第29頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四破碎率的測定1.直接測定法2.測定釋放的蛋白質量或酶的活力或相對電導率第30頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四破碎技術的新進展①多種破碎方法相結合：凍融法與勻漿法結合破碎酵母，有效提高破碎率②與上游過程相結合：利用病毒進行裂解溶胞③將細胞破碎與后續(xù)分離結合：珠磨法與雙水相萃取第31頁，共32頁，2023年，2月20日，星期四5.基因工程表達產物的后處理

——包含體的分