微生物菌種鑒定與保藏

微生物菌種鑒定與保藏1第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四2內(nèi)容菌種篩選菌種鑒定菌種保藏第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四3微生物代謝產(chǎn)物的平板檢測方法有機(jī)酸:

檸檬酸:pH指示劑的顏色變化,或摻入瓊脂平板的碳酸鈣的溶解.胞外酶:1.淀粉酶:由碘指示的可溶性淀粉的液化2.蛋白酶:酪蛋白的溶解3.脂酶:乳化的三丁酸甘油酯的消化,清除或向橄欖油瓊脂中添加0.05-0.25%的OsO4溶液4.果膠酶:果膠凝膠的液化(1.5%的聚果膠酸鈉),多糖沉淀劑5.彈性蛋白酶:彈性蛋白的溶解6.核酸酶(DNA,RNA):未水解的核酸的沉淀,酸過量時(shí)可見混濁.或者氮蒽橙熒光和紫外熒光7.磷酸脂酶C:卵磷脂平板的混濁圈8.磷酸脂酶A:卵磷脂平板的透明圈9.纖維素酶:纖維素平板的透明圈10.酯酶:氯化鈣和Tween20釋放出的月桂酸反應(yīng)生成月桂酸鈣沉淀.或者7-羥-4甲基香豆素?zé)晒夥磻?yīng).DNA酶:亞甲胺藍(lán)的DNA熒光變化過氧化酶:噴灑對-茴香堿-過氧化氫酶抑制劑:(用含酶的瓊脂平板上的抑制圈篩選)1.胰蛋白酶抑制劑:2.蛋白酶抑制劑

其他的代謝物:1.脂類.酵母的脂類營養(yǎng)缺陷型的生長譜來撿出2.NAD:以豬流感嗜血菌（haemophilusinflluenzae）的生長譜來撿出3.雌激素:噴灑對硝基苯重氮鹽（1%在50%乙酸中）形成紅色撿出4.chlorostatin:Euglenagracilis褪綠圈

第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四4第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四5第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四6第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四7影印法第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四8顯微鏡第一代第二代第三代第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四9細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察在顯微鏡下觀察細(xì)菌個體的形態(tài)細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)生變化。第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四10

細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。菌落特征與組成菌落的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長狀況、排列方式、好氣性和運(yùn)動性直接相關(guān)。第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四11

細(xì)菌個體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡單染色、鑒別染色、特殊染色。第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四12

放線菌菌落在培養(yǎng)基上著生牢固，與基質(zhì)結(jié)合緊密，難以用接種針挑取。放線菌細(xì)胞一般呈分枝無隔的絲狀，菌絲體分為在培養(yǎng)基內(nèi)部的基內(nèi)菌絲和伸出培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。氣生菌絲上部分化成孢子絲，呈螺旋狀、波浪狀或分枝狀。菌絲呈各種顏色，有的能分泌水溶性色素到培養(yǎng)基內(nèi)。孢子絲長出孢子，孢子形狀各異。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉狀。鏈霉菌第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四13

霉菌是由交織在一起的菌絲體構(gòu)成。菌絲呈管狀，有的有橫隔將菌絲分割為多細(xì)胞（如青霉、曲霉），有的菌絲沒有橫隔（如毛霉、根霉）。菌絲直徑比一般細(xì)菌和放線菌菌絲大幾倍到幾十倍。菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，顏色各異，有絲狀、絨毛狀或蜘蛛網(wǎng)狀的菌絲體。將菌絲體放在水中易變形，將其置于乳酸石炭酸溶液中，保持菌絲體原形。第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四14幾類酵母的菌落形態(tài)1.釀酒酵母2.產(chǎn)骯假絲酵母3.出芽短梗霉4.多孢絲抱酵母5.莢復(fù)膜孢酵母6.解脂復(fù)膜孢酵母7.季也蒙有孢漢遜酵母8.碎囊漢遜酵母9.卡氏酵母10.魯氏酵母11.深紅酵母12.玫紅法佛酵母13.大型羅倫隱球酵母14.美極梅奇酵母15.淺紅酵母第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四15第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四16一些鑒別培養(yǎng)基第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四17

來源于不同微生物的抗生素放線菌產(chǎn)生鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、利福霉素慶大霉素、麥迪霉素、林可霉素等真菌產(chǎn)生青霉素、頭孢菌素C等細(xì)菌產(chǎn)生 多粘菌素、桿菌肽等

目前已篩選出抗生素達(dá)9000種以上，每年還新增百余種。投入生產(chǎn)的僅百余種。菌種—發(fā)酵工業(yè)的核心第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四18CurrentMethodsofIdentification第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四19BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四20檢測原理BIOLOG以檢測微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過程中產(chǎn)生的酶與四唑類物質(zhì)（如TTC、TV）發(fā)生顏色反應(yīng)和濁度差異為基礎(chǔ)，運(yùn)用獨(dú)有的顯型排列技術(shù)檢測出每種微生物的特征指紋圖譜，在大量試驗(yàn)和數(shù)學(xué)模型基礎(chǔ)上，建立起指紋圖譜與微生物種類相對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。檢測時(shí)通過智能軟件將待鑒定微生物的圖譜與數(shù)據(jù)庫參比，即可得出鑒定結(jié)果。第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四21鑒定步驟分離純化平板擴(kuò)大培養(yǎng)制備菌懸液調(diào)整濁度接種培養(yǎng)獲取結(jié)果第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四22TheBacterialIdentificationProcess第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四23TheFungiIdentificationProcess第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四24PureCulturesareImportantKrieg,Bergey’sManual,1986第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四25挑取菌落用木制接種棒挑取分離良好的單菌落

第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四26BIOLOG常用消耗品Microlog1Microlog2Microlog3(Microstation)培養(yǎng)基BUG，BUABUG，BUABUG，BUA，BUY鑒定板GN2,GP2,ANGN2,GP2,ANGN2,GP2,AN,YT,FF接種液GN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IF,FF-IF其它通用消耗品疏基乙酸鈉，水楊酸鈉，試管架，吸嘴，加樣槽，一次性移液管，長棉簽，木制接種棒。第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四27微生物鑒定（95種碳源）微生物研究GN2鑒定革蘭氏陰性好氧菌GP2鑒定革蘭氏陽性好氧菌AN鑒定厭氧菌YT鑒定酵母菌FF鑒定絲狀真菌SF－N2用于革蘭氏陰性放線菌和真菌代謝研究SF－P2用于革蘭氏陽性放線菌和真菌代謝研究ECO用于微生物特性和群落分析研究（31）MT2用于微生物代謝研究（不含碳源）ES用于埃希氏大腸桿菌沙門氏菌的研究（95種碳源）鑒定板種類第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四28第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四29第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四30ElectronmicrographofstrainZJB-05174cells第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四31分子遺傳學(xué)鑒定

第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四32GenomicDNAextraction第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四33Primersdesign16S/18SrDNAsequenceamplification第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四34DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四35DNAsequencingmachinesuse

fluorescentdideoxynucleotides第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四36第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四37第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四38第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四39第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四40第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四41第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四42第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四43微生物菌種保藏及其專利申請

按照1977年4月28日各國于布達(dá)佩斯簽訂于1980年9月26日修正的《國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約》的解釋，“微生物菌種保藏”的概念是：“向接收與受理微生物的國際保存單位送交微生物或由國際保存單位貯存此種微生物，或兼有上述送交與貯存兩種行為”。如果發(fā)明涉及新的微生物、微生物學(xué)方法或者其產(chǎn)品，而且使用的微生物是公眾不能得到的，在申請專利前或最遲在申請日，必須按各國的專利法的有關(guān)規(guī)定對微生物進(jìn)行保藏，申請專利時(shí)還需提供相應(yīng)的申請文件。第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四44國際承認(rèn)用于專利程序的

微生物保藏布達(dá)佩斯條約

1.締約國允許或要求保存用于專利程序的微生物的,應(yīng)承認(rèn)為此種目的而在任一國際保存單位所做的微生物保存。這種承認(rèn)應(yīng)包括承認(rèn)由該國際保藏單位說明的保存事實(shí)和交存日期，以及承認(rèn)作為樣品提供的是所保藏的微生物樣品。2.任一締約國均可索取由國際保藏單位發(fā)出的(1)

項(xiàng)所述保藏的藏單副本。

第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四45我國專利法還應(yīng)辦理下列手續(xù)1.在申請日前或者最遲在申請日，將該微生物菌種提交專利局指定的微生物菌種保藏單位保藏，并在申請時(shí)或者最遲自申請日起三個月內(nèi)提交保藏單位出具的保藏證明和存活證明；期滿未提交證明的，該菌種被視為未提交保藏；2.在申請文件中，提供有關(guān)微生物特征的資料；3.涉及微生物菌種保藏的專利申請應(yīng)當(dāng)在請求書各說明書中寫明該微生物的分類命名（注明拉丁文名稱）、保藏該微生物菌種的單位名稱、地址、保藏日期和保藏編號；申請時(shí)未寫明的，應(yīng)當(dāng)自申請日起三個月內(nèi)補(bǔ)正；期滿未補(bǔ)正的，該菌種被視為未提交保藏。

第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四46第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四47對基因的占有方式是“基因?qū)＠?/p>

基因?qū)＠ＷC了專利擁有者對基因應(yīng)用領(lǐng)域的高度壟斷，其潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值和高額回報(bào)使得各國的研究機(jī)構(gòu)和大小公司紛紛投入巨額資金。難以想象，如果沒有專利的保護(hù)，制藥公司還會不會對基因開發(fā)下這么大的賭注，還會不會有基因相關(guān)產(chǎn)品走向市場。正是因?yàn)榛驅(qū)＠x予的高度壟斷，生物技術(shù)領(lǐng)域每一項(xiàng)重要產(chǎn)品的問世幾乎都會引來激烈的專利之爭。

第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四48基因?qū)＠纳虡I(yè)價(jià)值

基因?qū)＠茄兄崎_發(fā)相關(guān)產(chǎn)品的基礎(chǔ)，基因?qū)＠臋?quán)利人不僅可以通過專利合作或轉(zhuǎn)讓獲得收益，而且還可以從基于該基因?qū)＠幕虍a(chǎn)物以及其他衍生產(chǎn)品后期銷售收入中按一定比例提成。一個具有重要功能的疾病或產(chǎn)物相關(guān)基因的專利，轉(zhuǎn)讓價(jià)值一般以千萬美元計(jì)，而以此開發(fā)的基因藥物年銷售額可高達(dá)幾億至幾十億美元。

第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四49基因藥靶的價(jià)值1998年9月，Millennium公司與Bayer公司簽訂了五年的基因藥物合作協(xié)議，Bayer公司將向Millennium支付總計(jì)4.65億美元(包括14%的股權(quán)投資)費(fèi)用，委托Millennium公司開發(fā)225種基因藥靶，平均每個基因藥靶的價(jià)值為207萬美元。促紅細(xì)胞生成素EPO：美國Amgen公司依賴EPO基因?qū)＠拈_發(fā)應(yīng)用，從一個瀕臨破產(chǎn)的企業(yè)成為美國生物工程醫(yī)藥領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊，其EPO1998年的銷售收入達(dá)到13.6億美元，而EPO的全球市場現(xiàn)已達(dá)到34億美元的銷售額。

第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四50基因?qū)＠姆尚Я?/p>

基因?qū)＠芊傻谋Ｗo(hù)，專利侵權(quán)將要受到法律的制裁。而且，專利授予與否的問題也要服從于法律。HIV受體專利基因?qū)＠膲艛嘈栽疝Z動，2000年2月16日美國主要從事人類基因測序和商業(yè)化開發(fā)的人類基因組科技股份有限公司(HGS)宣布："她向美國專利和商標(biāo)局(PTO)成功申請了一個在HIV(艾滋病病毒)感染中起關(guān)鍵作用的基因的專利，該基因編碼一個稱作CCR5的細(xì)胞表面受體蛋白，該蛋白是HIV病毒侵入人體細(xì)胞所必需結(jié)合的位點(diǎn)。HGS指出：“該專利覆蓋了艾滋病治療的關(guān)鍵點(diǎn)”，HGS已授權(quán)其制藥業(yè)的合作伙伴開發(fā)艾滋病治療類藥物，HGS本身也試著進(jìn)行一些對付HIV感染的有關(guān)抗體的研究。HGS預(yù)計(jì)：“以CCR5為藥靶開發(fā)的新藥，包括艾滋病治療類藥物以及抗?jié)兒涂惯^敏類藥物，每年的銷售額能達(dá)到400億美元。”消息公布后，HGS股價(jià)當(dāng)天創(chuàng)出新高，達(dá)到188美元/股，一天內(nèi)漲幅高達(dá)21%。

第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四51HGS僅僅因?yàn)閷CR5基因測了序，就獲得了基于CCR5的有關(guān)專利權(quán)，而1996年那些首先發(fā)現(xiàn)“HIV通過與CCR5受體結(jié)合而侵染人體免疫細(xì)胞”的科學(xué)家以及那些在愛滋病研究領(lǐng)域做出了巨大貢獻(xiàn)的科學(xué)家，卻因在專利申請上比HGS晚了一步而無法享用基于CCR5基因的有關(guān)專利?？茖W(xué)家們認(rèn)為“專利局把CCR5基因的潛在商業(yè)價(jià)值優(yōu)先給予了一個只是做些基因測序等輔助工作的公司，而不授予為識別該受體、研究其功能做了大量科研工作的科學(xué)家，實(shí)在不太公平。”專利局的態(tài)度是，他們?nèi)匀豢梢允芾砥渌膶＠?。但專利之間的相互交叉和覆蓋勢必會產(chǎn)生碰撞，難免帶來嚴(yán)重的法律問題。然而，HGS并不認(rèn)為她僅僅是通過基因測序而獲得了CCR5的優(yōu)先權(quán)，她是以測序結(jié)果為切入點(diǎn)，通過基因數(shù)據(jù)庫的計(jì)算機(jī)分析推測基因的功能，然后再通過生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行基因功能的研究和相關(guān)藥物的開發(fā)的。不過，HGS承認(rèn)她在提交CCR5專利申請的時(shí)候并不知道CCR5與艾滋病之間的關(guān)系。HGS認(rèn)為發(fā)現(xiàn)CCR5生物學(xué)功能的科學(xué)家們應(yīng)該得到認(rèn)可，HGS將在科研方面與科學(xué)家們共享CCR5的有關(guān)數(shù)據(jù)和試劑，但在相關(guān)藥物開發(fā)方面，HGS是要嚴(yán)格執(zhí)行其專利權(quán)利的。由此可見，誰擁有了基因?qū)＠?，誰就擁有了該基因所有用途的獨(dú)占性開發(fā)權(quán)，實(shí)現(xiàn)的將是對整個產(chǎn)業(yè)的壟斷。第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四52生物技術(shù)專利戰(zhàn)略

當(dāng)今全球性經(jīng)濟(jì)競爭是一種以科技競爭為中心的角逐，而最先進(jìn)的科技發(fā)明信息有90％被收集在專利文獻(xiàn)中，專利保護(hù)對鼓勵工業(yè)領(lǐng)域的創(chuàng)造和促進(jìn)產(chǎn)品的開發(fā)和銷售起著重要作用。因?yàn)閯?chuàng)造性受到專利法的保護(hù)，所以，企業(yè)就愿意投資研究新技術(shù)，開發(fā)新產(chǎn)品。近年來，各國科學(xué)家們也深切地體會到，傳統(tǒng)的科學(xué)宗旨已讓位于自我利益，擁有專利和對專利的追求將激發(fā)新的發(fā)明創(chuàng)造，從發(fā)明創(chuàng)造中獲得公共的關(guān)注和經(jīng)濟(jì)資助變成了科學(xué)研究的原動力。西方大公司是世界上發(fā)明專利的主要申請者和利用者，其專利戰(zhàn)略就是如何有目的、有效地利用這一制度。

第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四53第53頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四54定義菌種保藏—是指在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株的基礎(chǔ)上，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不污染以便于研究、交換和使用的目的。

第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的保藏第54頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四55

菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平，缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法，首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變。菌種保藏的原理第55頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四56

菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：A斜面冰箱保藏法斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長豐滿后，放在4℃冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月。第56頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四57B沙土管保藏法

這是國內(nèi)常采用的一種方法。適合于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物。制備方法：首先，將沙與土洗凈烘干過篩后，按沙與土的比例為l－2∶l混合均勻，分裝于小試管中，裝料高度約為1厘米左右，121°C間歇滅菌三次，滅菌試驗(yàn)合格后烘干備用。一般沙用80目過篩，土用30－100目過篩。其次，將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或?qū)⑿泵骀咦庸蜗轮苯优c沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱內(nèi)保存。一般保存期為1年左右。第57頁，共62頁，2023年，2月20日，星期四58C、石蠟油封存法向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中