聯(lián)合應(yīng)用常染色體STR、X

聯(lián)合應(yīng)用常染&體STR.X-STR和^粒體SNP%^y缺失雙親姐妹同胞關(guān)系王曉勛;陳敏;李瑞明;賀嬌;王彥濤;羅銀州【摘要】目的：對雙親缺失的姐妹進(jìn)行同胞鑒定。方法采用chelex-100法提取血液DNA，通過檢測常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat，STR)位點、X染色體STR位點和線粒體單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)進(jìn)行基因分型，分型結(jié)果通過判別函數(shù)、ITO法、X染色體STR位點和線粒體SNP分析的方法進(jìn)行同胞關(guān)系判定。結(jié)果39個常染色體等位基因位點的共享基因數(shù)為27個，用辨別函數(shù)判別歸于無關(guān)個體；用ITO法計算親緣關(guān)系系數(shù)(FSI)為6.95003x10-44，判別為無關(guān)個體；12個X染色體STR等位基因位點中，有3個X染色體STR位點不匹配，排除姐妹倆來自同一父親；線粒體SNP的檢測顯有3個基因座不同，兩人來源于不同母系。結(jié)論通過聯(lián)合利用常染色體STR、X染色體STR和線粒體SNP檢測技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)兩人不是同胞姐妹關(guān)系。%ObjectiveTocarryoutasiblingidentificationontheorphanedsisters.MethodsGenomicDNAoftwoladieswereextractedbyusingchelex-100method.GenotypingwasperformedbydetectingSTRslocionautosome,STRlocionX-chromosomeandmitochondrial-SNPloci.Thenthedatawereanalyzedbydiscriminantfunctionanalysis,ITOmethod,X-STRanalysisandmitochondrial-SNPanalysistoidentifythesiblingrelationoftheorphanedsisters.ResultsTherewere27sharedlociamong39STRslociontheautosome,whichwereconsideredasunrelatedindividualsbasedondiscriminantfunctionanalysisandITOmethod.3inconsistentlociweredetectedamong12X-STRloci,whichimpliedthatthetwosistersdidn'thaveabiologicalfather.3inconsistentlociweredetectedamong49mitochondrial-SNPloci,whichsuggestedthattheydidn'thaveabiologicalmother.ConclusionThejointuseofthetechnologyofautosomeSTR,X-chromosomeSTRandmitochondrial-SNPdeterminedthattwoladieswerenotsiblingrelationship.【期刊名稱】《分子診斷與治療雜志》【年(卷)，期】2014(000)006【總頁數(shù)】6頁(P366-371)【關(guān)鍵詞】親權(quán)鑒定;同胞關(guān)系鑒定;法醫(yī)遺傳學(xué)【作者】王曉勛;陳敏;李瑞明;賀嬌;王彥濤;羅銀州【作者單位】湖北省十堰市太和醫(yī)院檢驗部法醫(yī)物證實驗室，湖北，十堰442000;湖北十堰市西苑醫(yī)院三堰門診部，湖北，十堰442000;湖北省十堰市太和醫(yī)院檢驗部法醫(yī)物證實驗室，湖北，十堰442000;湖北醫(yī)藥學(xué)院第二臨床學(xué)院，湖北，十堰442000;湖北省十堰市公安局刑事物證實驗室，湖北，十堰442000;湖北省十堰市公安局刑事物證實驗室，湖北，十堰442000【正文語種】中文父母缺失的同胞鑒定，除有較多同胞兄弟姐妹，可以依據(jù)同胞個體來重塑其父母的等位基因型［1-2］。但在特殊情況下，僅有兩人，沒有其它兄弟姐妹情況下，就沒有辦法更準(zhǔn)確的重塑生父母的等位基因型，必須依據(jù)性別的不同，需要利用常染色體，X染色體或Y染色體STR(shorttandemrepeat,STR)以及線粒體位點的匹配情況進(jìn)行判斷［1-2］。常染色體用于同胞親緣關(guān)系的鑒定已經(jīng)報道很多［1-2］。判別函數(shù)法的平均錯判率較高，特別對于共享基因得分在判別函數(shù)辨別點附近的樣本顯出更高的錯判率［1-2］，實際應(yīng)用中已經(jīng)得到證實。所以增加檢測更多的常染色體STR等位基因座等位基因的檢測。利用ITO法［3］得到親緣指數(shù)、以及依據(jù)案例實際情況的不同加做X染色體、Y染色體以及線粒體位點的檢測可以更可靠明確判斷，被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)親權(quán)鑒定領(lǐng)域［3-5］。本文闡述了聯(lián)合利用常染色體、X染色體和線粒體SNP這些檢測方法來判別父母缺失，無其它同胞個體之間進(jìn)行同胞親緣關(guān)系鑒定。案情簡介：一女士（李）要求與另一女士（吳）進(jìn)行全同胞鑒定。敘述兩人來自共同的父母，多年前由于家庭困難，父母送其妹妹給別人家撫養(yǎng)。以后沒有任何聯(lián)系，吳女士自敘年齡和其送出去的妹妹一致，送出地點和發(fā)現(xiàn)地點也很吻合，李女士和吳女士相貌相似（有照片和她們之間的敘述為證）。自敘她們一起去看牙齒，牙醫(yī)敘述其牙齒周圍結(jié)構(gòu)也很一致。并說明除她們以外沒有其它同胞兄弟姐妹。1.1樣本抽取兩人耳垂血，分別編號用于同胞鑒定。標(biāo)本一：李女士血液；標(biāo)本二：吳女士血液。1.2試劑和儀器美國應(yīng)用生物有限公司ABIAmPISTR?Identifiler?試劑盒、中德美聯(lián)AGCUExpressmarker22試劑盒、AGCUExpressmarker21+1試劑盒、AGCUX12STR試劑盒。AGCUMitochondrialSNP試劑盒。美國ABI310遺傳分析儀，PE公司PE9600擴增儀。EPPENDORF離心機。1.3方法等位基因座的各等位基因的分型采用常染色體試劑盒。收集血液標(biāo)本，用chelex法提取DNA，定量后用于復(fù)合PCR擴增。采用的試劑盒是AmPISTRIdentifiler試劑盒、AGCUExpressmarker22試劑盒、AGCUExpressmarker21+1試劑盒用于常染色體STR檢測。X染色體STR采用AGCUX12STR試劑盒，用于對兩個自稱姐妹進(jìn)行X性伴隨染色體線粒體的檢測來判斷是否來自同一父系。對判斷是否來自同一母系，采用AGCUMitochondrialSNP試劑盒，反應(yīng)體積12.5",PCR反應(yīng)條件參考各試劑盒說明，甲酰胺猝冷變單鏈，ABI310ABI3500DX毛細(xì)管電泳。收集數(shù)據(jù)，應(yīng)用相應(yīng)的分析軟件collection3.0收集電泳數(shù)據(jù)，genemap3.1完成位點和等位基因座等位基因的分型。2.115個常染色體STR等位基因座等位基因分型結(jié)果如表1所示，根據(jù)Identifiler試劑盒檢測的兩位女士的常染色體STR分型結(jié)果，15個STR等位基因座中兩人具有的共享基因數(shù)是7個。依據(jù)我們建立的本系統(tǒng)的判別函數(shù)判別為無關(guān)個體組，此判別函數(shù)平均錯判率為0.0298。2.224個常染色體等位基因座等位基因分型結(jié)果（除表一外的等位基因座）如表2所示，AGCUExpressmarker22試劑盒、AGCUExpressmarker21+1試劑盒共計檢查39個常染色體STR位點，1個性染色體STR位點。除與ABIAmPISTRIdentifiler試劑盒相同外的所有常染色體STR等位基因座位點。全部39個常染色體STR基因座共檢測狀態(tài)一致性等位基因（共享基因）共27個，19個必檢基因座加10個補充的STR基因座共18個狀態(tài)一致性等位基因（共享等位基因），（Identitybystatescore,IBS）（18）＜21，傾向于兩女士為無關(guān)個體。2.312個X染色體STR基因座等位基因分型結(jié)果如表3所示，兩女士使用AGCUX12X-STR試劑盒進(jìn)行X染色體STR分型，有DXS981、DXS6789、DXS10不匹配，不符合孟德爾遺傳規(guī)律，排除兩女士來自同一父親。2.4熒光標(biāo)記的線粒體SNP位點檢測試劑盒檢測結(jié)果本實驗應(yīng)用中德美聯(lián)AGCUMitochondrialSNP試劑盒檢測了59個線粒體SNP位點分型信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩人補充位點共有3個線粒體SNP基因座不同：李女士于16319位點為A，8794位點為T堿基，16126位點為C堿基；吳女士16139位點為G，8794位點為C，16126位點為T堿基。查閱人類線粒體進(jìn)化樹，判斷李女士歸為A5b1單倍群，吳女士不屬于A單倍群，顯示兩位女士的線粒體單倍群不同，此兩女士不是來自同一母系（見圖1表4）。2.5生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定狀態(tài)一致性得分（identitybystatescore,IBS）如表5顯示，19個常染色體位點和19個規(guī)定常染色體加10個獨立性常染色體等位基因位點以及20個獨立常染色體等位基因位點的狀態(tài)一致性評分（IBS）分別是10、18和27，得分依據(jù)規(guī)范判斷傾向于認(rèn)為兩名被鑒定人為無關(guān)個體。父母缺失的同胞鑒定，一直以來鑒別起來比較繁瑣，常用的方法就是收集兄弟姐妹的血液進(jìn)行常規(guī)父母染色體STR等位基因分型重塑，推斷其共同生父和生母的STR等位基因型用于同胞的親緣鑒定，雖然此法可以推斷共同生母和生父的基因型，但需要有較多的同胞兄弟姐妹為前提，當(dāng)子代僅限于兩人的情況下，獲得共同生母生父的常染色分型就變得異常困難，就需要進(jìn)行常染色體共享基因法和親緣關(guān)系的ITO法來判別兩人歸屬［3,5］。由于共享基因法是依據(jù)判別函數(shù)來進(jìn)行判別，特別在所用常染色體等位基因座數(shù)目不充分時，其判別的平均錯判率比較高，特別是在判別點周圍錯判率更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于平均錯判率。在司法部沒有頒布生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定實施規(guī)范之前各實驗室采用的判別方法不同（采用的常染色體等位基因座類型不同、數(shù)量不同）。在規(guī)范發(fā)布前用共享基因法來判別同胞關(guān)系中，由于用15常染色體等位基因座建立的判別函數(shù)來判別結(jié)果被錯判的平均概率為2.98%。僅依據(jù)此判別函數(shù)判斷結(jié)果有一定的風(fēng)險［5-8］。ITO法需要檢測更多的常規(guī)染色體STR才能得到比較可靠的結(jié)論［3］，除此之外依據(jù)性別的不同可以加做X或Y染色體STR的檢查，必要的時候還需要進(jìn)行線粒體位點的檢查以便支持和驗證上敘判別結(jié)論。本文中兩女性共同敘述父母皆離世，沒有其它兄弟姐妹。并且看似相貌類似，共述年齡與當(dāng)年送養(yǎng)時期推算的年齡一致，送養(yǎng)地點記憶也很同一，并且其自敘兩人一起看牙醫(yī)，牙醫(yī)說兩人牙齒結(jié)構(gòu)都很相似等支持兩女士為同胞姐妹的供述。本文用ABIAmPISTRIdentifiler試劑盒對兩人的常染色體進(jìn)行了分型，其共享基因數(shù)為7，用判別函數(shù)進(jìn)行歸類判別，此兩女性個體被歸于無關(guān)個體，與上述兩人描述產(chǎn)生了矛盾，考慮到15個等位基因座判別函數(shù)的平均錯判率為2.98%。逐增加常染色體STR等位基因分型的檢查，加做AGCUExpressmarker22試劑盒、AGCUExpressmarker21+1共計除ABIAmPISTRIdentifiler試劑盒里15個STR外的24常染色體STR，總計有39個常染色體STR基因座，在總共39個常染色體等位基因位點的共享基因數(shù)為27個。得到的分型結(jié)果用ITO法進(jìn)行親緣關(guān)系系數(shù)（FSI）的計算。其兩個個體39個常染色體等位基因座分型累積親緣關(guān)系指數(shù)計算為6.95003x10-44［3］?？梢耘袆e為無關(guān)個體，為了使得共享等位基因法判別函數(shù)和ITO法判斷的結(jié)果得到進(jìn)一步證實。繼續(xù)進(jìn)行X染色體STR和線粒體SNP位點檢測。如果兩人系同一父親，其來自父系的X染色體單倍體等位基因座分型結(jié)果應(yīng)該相同（在排除突變的情況下）［4-5］。由于兩姐妹父母早年已逝，兩人對父母生活的實際情況未必能完全了解，所以應(yīng)該排除其是同母異父的半同胞的可能性。對兩人進(jìn)行X染色體12個STR等位基因座分型檢測，所用試劑為AGCUX12X-STR試劑盒。結(jié)果見表3。有三個等位基因座等位基因分型不符合孟德爾遺傳規(guī)律［6,9-11］?？紤]到DXS6789基因座分型結(jié)果超越了一個重復(fù)序列，并且有3個位點的不符合，可以排除兩人系同一父親。由于自稱姐妹的兩人，長相近同，且都像她們印象中的母親，所以為了更進(jìn)一步確認(rèn)兩人是否為同母異父同胞，加做線粒體SNP位點分型。所用試劑為AGCUMitochondrialSNP試劑盒。結(jié)果見表4。結(jié)果顯示HEX色線粒體SNP位點信息完全一致。TAMARA色及FAM,HEX補充位點共有3個基因座單核苷酸不同。李女士于16319位點為A，8794位點為T堿基，16126位點為C堿基，故歸為A5b1單倍群；結(jié)果見圖1。對應(yīng)的吳女士16139位點為G，8794位點為C，16126位點為T堿基。因此排除2個樣本來自同一母系。結(jié)論排除吳女士和李女士是同胞姐妹關(guān)系［7-8］。關(guān)于同胞鑒定司法部頒布的生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定實施規(guī)范，對全同胞的司法鑒定做了全面的闡述，我們應(yīng)用這一規(guī)范，在此規(guī)范的范圍內(nèi)利用狀態(tài)一致性評分（IBS），用三種不同數(shù)目等位基因座記分系統(tǒng)進(jìn)行積分，結(jié)果見表5，在規(guī)定的19個常染色體位點和19個規(guī)定常染色體加10個獨立性常染色體等位基因位點的狀態(tài)一致性評分（IBS）分別是10和18,得分依據(jù)規(guī)范判斷傾向于認(rèn)為兩名被鑒定人為無關(guān)個體。與以上得出的最終結(jié)論一致。本實施規(guī)范定義的生物學(xué)全同胞關(guān)系特指在雙親皆無情形下甄別全同胞和無關(guān)個體兩種檢驗假設(shè)。鑒定人應(yīng)詳細(xì)了解兩名被鑒定人間是否存在其它可能的親緣關(guān)系，若兩名被鑒定人間存在其他親緣關(guān)系（如半同胞、堂表親等），則本實施規(guī)范不適用［12-15］。所以在結(jié)論與先前的陳述思維和觀察結(jié)果不一致，不能確定是否為同父的情況下，本文聯(lián)合對自稱是全同胞姐妹兩人進(jìn)行常染色體、X染色體STR等位基因位點以及線粒體SNP位點進(jìn)行聯(lián)合檢測，依據(jù)常染色體STR共享基因判別式得出的結(jié)論。后面利用乂染色體和線粒體SNP位點從父系、母系的兩個方面進(jìn)行論證得出結(jié)論。最后再用司法部頒布的生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定實施規(guī)范的方法進(jìn)行驗證。全同胞鑒定常染色體STR依據(jù)判別函數(shù)判別在判別點周圍有比較高的錯判率，應(yīng)該嚴(yán)格依照司法部頒布的生物學(xué)全同胞關(guān)系鑒定實施規(guī)范的方法進(jìn)行驗證，在不能確定同父同母的情況下，特別是當(dāng)先前的觀察和調(diào)查與所做的結(jié)論不一致時，聯(lián)合利用X、Y、線粒體測序等檢測手段得出結(jié)論是必要的，應(yīng)該引起鑒定人的重視?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】趙書民，李成濤漲素華，等.應(yīng)用常染色體STR基因座共有等位基因數(shù)判別全同胞關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(4):267-270.陳子翔，福振，陸惠玲，等.判別函數(shù)在同胞鑒定中的應(yīng)用[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2012,27(2):129-132.陸惠玲，楊慶恩.用ITO法計算兩個體間的血緣關(guān)系機會[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2002,17(3):188-191.SchillerJJ,HoppKA,PietzBC,etal.AsimplifiedmethodforscreeningsiblingsforHLAidentityusingshorttandemrepeat(STR)polymorphisms[J].HumImmunol,2013,74(5):562-568.PuCE,LinacreA.Systematicevaluationofsensitivityandspecificityofsibshipdeterminationbyusing15STRloci[J].JForensicLegMed,2008,15(5):329-363.唐澤英，陸惠玲.常染色體STR_X染色體STR鑒定姐妹關(guān)系一例[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2010,51(4):57-58.張素華，趙書民，李莉，等.采用STR和SNP遺傳標(biāo)記鑒定全同胞姐妹關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(3):185-187.張素華，趙書民，李莉，等.采用STR和SNP遺傳標(biāo)記鑒定全同胞姐妹關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(3):185-187.KapinskaE,WysockaJ,CybulskaL,etal.ExamplesofapplicationofXchromosomalmarkersinfamilialinvestigationsandpersonalidenti