生物化學(xué)rna的合成藥學(xué)

第十六章RNA的生物合成RNABiosynthesis(Transcription)轉(zhuǎn)錄(transcription)是生物體以DNA為模板合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄RNADNA

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除mRNA、rRNA和tRNA外，在真核細(xì)胞內(nèi)還有snRNA、miRNA等非編碼RNA。復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)：原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:

DNA酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白質(zhì)因子及Mg2+和Mn2+等合成方向5→3，核苷酸間的連接方式為3，5-磷酸二酯鍵。原核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶Templates&Enzymesinprokaryotictranscription第一節(jié)一、原核生物轉(zhuǎn)錄的模板DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)。轉(zhuǎn)錄的這種選擇性稱為不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)，它有兩方面含義：在DNA分子雙鏈上，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；其二是模板鏈并非總是在同一單鏈上。5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。相對的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈(codingstrand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向不對稱轉(zhuǎn)錄二、RNA聚合酶催化RNA合成（一）RNA聚合酶能從頭啟動(dòng)RNA鏈的合成DNA依賴的RNA聚合酶催化合成RNA；RNA合成的化學(xué)機(jī)制與DNA依賴的DNA聚合酶催化DNA合成相似。(NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPiRNA延長的RNADNA依賴的RNA聚合酶催化RNA合成的機(jī)制（二）RNA聚合酶由多個(gè)亞基組成核心酶

(coreenzyme)全酶

(holoenzyme)轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄延長階段原核生物的轉(zhuǎn)錄過程TheProcessofTranscriptioninProkaryote第二節(jié)原核生物的轉(zhuǎn)錄過程可分為轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄延長和轉(zhuǎn)錄終止三個(gè)階段。

RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。一、轉(zhuǎn)錄起始需要RNA聚合酶全酶轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問題：2.DNA雙鏈打開，形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(opentranscriptioncomplex)

；DNA分子接近-10區(qū)域的部分雙螺旋解開后轉(zhuǎn)錄開始。

DNA雙鏈解開的范圍只在17bp左右，這比復(fù)制中形成的復(fù)制叉小得多。1.

RNA聚合酶全酶(2)識別并結(jié)合啟動(dòng)子，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（closedtranscriptioncomple）；3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成第一個(gè)磷酸二酯鍵：RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:5-pppG-OH+

NTP5-pppGpN

-OH3+ppi轉(zhuǎn)錄起始過程：E.coli的轉(zhuǎn)錄起始和延長第一個(gè)磷酸二酯鍵生成后，轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的構(gòu)象發(fā)生改變，σ亞基即從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上脫落，核心酶連同四磷酸二核苷酸，繼續(xù)結(jié)合于DNA模板上，酶沿DNA鏈前移，進(jìn)入延長階段。σ若不脫落，RNApol則停留在起始位置，轉(zhuǎn)錄不繼續(xù)進(jìn)行。每個(gè)原核細(xì)胞中RNApol各亞基比例：α：β：β‘：σ=4000:2000:2000:600RNA生成量與核心酶成正比，σ脫落后可反復(fù)使用。二、RNApol核心酶獨(dú)立延長RNA鏈1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄泡局部結(jié)構(gòu)示意轉(zhuǎn)錄空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）

····DNA

····RNA轉(zhuǎn)錄延長以下特點(diǎn)①核心酶負(fù)責(zé)RNA鏈延長反應(yīng)；②RNA鏈從5-端向3-端延長，新的核苷酸都是加到3-OH上；③對DNA模板鏈的閱讀方向是3-端向5-端，合成的RNA鏈與之呈反向互補(bǔ)，即酶是沿著模板鏈的3向5方向或沿著編碼鏈的5向3方向前進(jìn)的；④合成區(qū)域存在著動(dòng)態(tài)變化的8bp的RNA-DNA雜合雙鏈；⑤模板DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)隨著核心酶的移動(dòng)發(fā)生解鏈和再復(fù)合的動(dòng)態(tài)變化。轉(zhuǎn)錄過程中DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)變化轉(zhuǎn)錄過程中DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)變化三、原核生物轉(zhuǎn)錄延長與蛋白質(zhì)的翻譯同時(shí)進(jìn)行53DNA核糖體RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)在進(jìn)行；轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進(jìn)行。依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止非依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止四、原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為依賴因子與非依賴因子兩大類轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。依據(jù)是否需要蛋白質(zhì)因子的參與，原核生物轉(zhuǎn)錄終止分為：因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。因子能結(jié)合RNA，又以對polyC的結(jié)合力最強(qiáng)，但對polydC/dG組成的DNA的結(jié)合能力就低得多。因子還有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。（一）依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止因子：因子的作用原理：（二）非依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；局部RNA/DNA雜化短鏈的堿基配對是最不穩(wěn)定的。RNA鏈上的多聚U也是促使RNA鏈從模板上脫落的重要因素。真核生物RNA的生物合成TheBiosynthesisofEukaryoteRNA第三節(jié)真核生物的轉(zhuǎn)錄過程比原核復(fù)雜。二者的轉(zhuǎn)錄起始過程有較大區(qū)別，轉(zhuǎn)錄終止也不相同。一、真核生物有三種DNA依賴的RNA聚合酶真核生物具有3種不同的RNA聚合酶:RNA聚合酶Ⅰ（RNAPolⅠ）RNA聚合酶Ⅱ（RNAPolⅡ）RNA聚合酶Ⅲ（RNAPolⅢ）真核生物的RNA聚合酶種類ⅠⅡⅢ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物rRNA的前體45SrRNAmRNA前體hnRNA,lncRNA,piRNA,miRNAtRNA,5SrRNAsnRNA對鵝膏蕈堿的反應(yīng)耐受敏感高濃度下敏感細(xì)胞內(nèi)定位核仁核內(nèi)核內(nèi)二、轉(zhuǎn)錄因子在真核生物轉(zhuǎn)錄起始中具有重要作用

與原核生物的顯著不同是，起始和延長過程都需要眾多相關(guān)的蛋白質(zhì)因子參與，這些因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionalfactors,TF）或反式作用因子（trans-actingfactors）。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游都有不同的特異DNA序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，統(tǒng)稱為順式作用元件(cis-actingelement)。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TATA盒CAAT盒GC盒增強(qiáng)子順式作用元件(cis-actingelement)AATAAA切離加尾轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)修飾點(diǎn)外顯子翻譯起始點(diǎn)內(nèi)含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，真核生物的RNApol不直接識別和結(jié)合模板的起始區(qū)，而是依靠轉(zhuǎn)錄因子識別并結(jié)合起始序列，故其起始復(fù)合體的裝配過程比原核生物復(fù)雜的多。相對應(yīng)于RNApolI、RNApolII、RNApolIII，這些TF分別稱為TFI、TFII、TFIII。參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ的作用轉(zhuǎn)錄因子功能TFⅡDTBP亞基結(jié)合TATA盒TFⅡA輔助TBP-DNA結(jié)合TFⅡB穩(wěn)定TFⅡD-DNA復(fù)合物，結(jié)合RNApolTFⅡE解螺旋酶,結(jié)合TFⅡHTFⅡF促進(jìn)RNApolⅡ結(jié)合及作為其他因子結(jié)合的橋梁TFⅡH解旋酶、作為蛋白激酶催化CTD磷酸化真核RNA聚合酶Ⅱ與通用轉(zhuǎn)錄因子的作用過程（二）少數(shù)幾個(gè)反式作用因子的搭配啟動(dòng)特定基因的轉(zhuǎn)錄為了保證轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性，不同基因需不同轉(zhuǎn)錄因子。拼板理論(piecingtheory)

：少數(shù)幾個(gè)反式作用因子（主要是可誘導(dǎo)因子和上游因子）之間互相作用，再與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶搭配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因?？烧T導(dǎo)因子和上游因子常常通過輔激活因子或中介子與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合，但有時(shí)也可直接與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶結(jié)合。三、真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程中沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體轉(zhuǎn)錄延長中的核小體移位轉(zhuǎn)錄方向四、真核生物的轉(zhuǎn)錄終止和加尾修飾同時(shí)進(jìn)行真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的。真核生物mRNA有聚腺苷酸(polyA)尾巴結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進(jìn)去的。轉(zhuǎn)錄不是在polyA的位置上終止，而是超出數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在讀碼框架的下游，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當(dāng)多的GT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)。5------AAUAAA-5------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)55333加尾AAAAAAA······3mRNA轉(zhuǎn)錄終止——

和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。真核生物RNA的加工和降解

TheProcessingandDegradationofEukaryoticRNA第四節(jié)真核生物轉(zhuǎn)錄生成的RNA分子是初級RNA轉(zhuǎn)錄物(primaryRNAtranscript)，幾乎所有的初級RNA轉(zhuǎn)錄物都要經(jīng)過加工，才能成為具有功能的成熟的RNA。加工主要在細(xì)胞核中進(jìn)行。幾種主要的修飾方式：1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修飾(modification)4.

添加(addition)5.RNA編輯(RNAediting)一、核不均一RNA經(jīng)首、尾修飾和剪接后成為mRNA

真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后，需要進(jìn)行5-端和3-端（首、尾部）的修飾以及對hnRNA進(jìn)行剪接（splicing），才能成為成熟的mRNA，被轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體，指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯。（一）前體mRNA在5-末端加入“帽”結(jié)構(gòu)大多數(shù)真核mRNA的5-末端有7-甲基鳥嘌呤的帽結(jié)構(gòu)。這個(gè)真核mRNA加工過程的起始步驟由兩種酶，加帽酶(cappingenzyme)和甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)催化完成。

帽結(jié)構(gòu)帽結(jié)構(gòu)的生成過程帽結(jié)構(gòu)的意義：可以使mRNA免遭核酸酶的攻擊；也能與帽結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合體(cap-bindingcomplexofprotein)結(jié)合，并參與mRNA和核糖體的結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的生物合成。（二）前體mRNA在3-端特異位點(diǎn)斷裂并加上多聚腺苷酸尾尾部修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同時(shí)進(jìn)行的過程。polyA的有無與長短，是維持mRNA作為翻譯模板的活性，以及增加mRNA本身穩(wěn)定性的因素。一般真核生物在胞漿內(nèi)出現(xiàn)的mRNA，其polyA長度為100至200個(gè)核苷酸之間，也有少數(shù)例外。前體mRNA分子的斷裂和加多聚腺苷酸尾是多步驟過程。AAUAAAG/U5’3’Poly(A)信號Poly(A)位點(diǎn)mRNACPSFG/U5’3’CPSFCFI,CFII,CStFCPSFCStFCFICFIIPAPCPSFCStFCFICFIIPAPATPG/UPPPiCFIICFICStF慢速多腺苷酸化PABⅡCPSFAAAAAAAAAAOHPAPATPPPiPABⅡ快速多腺苷酸化CPSFAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAHOAAAAAAAAAAPAPCPSFAAAAAAAAAAOHPAP（三）前體mRNA的剪接主要是去除內(nèi)含子在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)的初級轉(zhuǎn)錄物的分子量往往比在胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的成熟mRNA大幾倍，甚至數(shù)十倍。核酸序列分析證明，mRNA來自hnRNA，而hnRNA和DNA模板鏈可以完全配對去除初級轉(zhuǎn)錄物上的內(nèi)含子，把外顯子連接為成熟RNA的過程稱為mRNA剪接（mRNAsplicing）。真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。斷裂基因(splitegene)CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)

外顯子：在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的