第二章微生物的保護(hù)和保藏詳解

第二章微生物的保護(hù)和保藏詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四（優(yōu)選）第二章微生物的保護(hù)和保藏現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四云南大學(xué)云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已建成西南微生物種質(zhì)資源庫(kù)、基因與蛋白、微生物發(fā)酵和次生代謝產(chǎn)物研究平臺(tái)?，F(xiàn)擁有2棟獨(dú)立科研大樓，總面積達(dá)5800平方米以上。設(shè)備總值達(dá)3000多萬(wàn)元。實(shí)驗(yàn)室的主要研究方向及研究領(lǐng)域?yàn)椋海?）特色生物的物種與遺傳多樣性：特色生物的基因多樣性，物種演化和區(qū)系演變的規(guī)律及其與地理環(huán)境變化的關(guān)系；動(dòng)物、植物與微生物協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系與規(guī)律；特色生物資源保護(hù)的策略。（2）資源微生物利用的基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)：具重要應(yīng)用前景的微生物資源評(píng)估和生物學(xué)基礎(chǔ)研究；微生物基因工程菌構(gòu)建及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)；植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)微生物農(nóng)藥研究；具活性的微生物次生代謝產(chǎn)物及先導(dǎo)化合物研究。（3）生物多樣性的生態(tài)功能與修復(fù)：污染及極端環(huán)境中植物、微生物的抗性、適應(yīng)及多樣性變化機(jī)制；山區(qū)土地植被變化與生物多樣性維持；關(guān)鍵區(qū)域受損生態(tài)系統(tǒng)的退化機(jī)制與恢復(fù)?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四微生物資源與人類(lèi)生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)系統(tǒng)在一定時(shí)間和空間內(nèi)，生物與其生存環(huán)境以及生物與生物之間相互作用，彼此通過(guò)物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息交換，形成的一個(gè)不可分割的自然整體?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四微生物與人類(lèi)生態(tài)系統(tǒng)的相互影響

微生物對(duì)人類(lèi)生態(tài)系統(tǒng)的影響

自然生態(tài)系統(tǒng)的主要分解者自然界中元素的平衡者土壤肥力的保持者人類(lèi)生態(tài)系統(tǒng)對(duì)微生物的影響

環(huán)境影響自然界微生物的生存

現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四微生物資源保護(hù)的重要性

維持生態(tài)系統(tǒng)平衡推動(dòng)生物技術(shù)發(fā)展---生物酶等基因資源庫(kù)大量微生物資源尚需發(fā)掘現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四微生物資源保護(hù)策略天然微生物資源的保護(hù)

保護(hù)微生物的棲息生存環(huán)境生產(chǎn)菌種和專(zhuān)利菌種的保護(hù)

知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)

加強(qiáng)微生物資源保護(hù)法律法規(guī)建設(shè)和宣傳工作

把微生物資源作為國(guó)家的戰(zhàn)略資源來(lái)認(rèn)識(shí)，開(kāi)發(fā)與保護(hù)并重現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四

目的：確保微生物生產(chǎn)性能穩(wěn)定、不染菌、不死亡等。原理：“休眠”

二、微生物物種資源的保藏現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四（一）菌種保藏的原理菌種保藏主要是根據(jù)微生物生理生化特點(diǎn)，人工制造環(huán)境條件，使微生物代謝處于不活潑，生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)，即采取低溫、干燥、缺氧三個(gè)條件，使菌種暫時(shí)處于休眠狀態(tài)。挑選典型菌種的優(yōu)良純種一般采用微生物的休眠體（如孢子、芽孢等）創(chuàng)造適于微生物長(zhǎng)時(shí)期休眠的環(huán)境條件（如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸堿中和劑等）現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四幾個(gè)概念1.衰退（degeneration）：在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中，由于變異的存在，使原有的優(yōu)良性狀發(fā)生負(fù)變，即菌種的衰退?，F(xiàn)在是10頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四2.復(fù)壯(rejuvenation)狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測(cè)定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四菌種的復(fù)壯措施純種分離純菌落的分離方法（平板表面涂布法，平板劃線(xiàn)分離法，瓊脂培養(yǎng)基澆注法）-菌落純純細(xì)胞的分離方法（利用培養(yǎng)皿或凹玻片等作分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離；顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離；不長(zhǎng)孢子的絲狀真菌，則可用無(wú)菌小刀切取菌落邊緣疏稀的菌絲尖端進(jìn)行分離移植，也可用無(wú)菌毛細(xì)管插入菌絲尖端，菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離）-菌株純現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四通過(guò)宿主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillusthuringiensis的復(fù)壯）對(duì)于寄生性微生物的退化菌株，可通過(guò)接種至相應(yīng)的昆蟲(chóng)或動(dòng)、植物宿主體內(nèi)的措施來(lái)提高它們的致病性。例如，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期人工培養(yǎng)的Bacillusthuringiensis，會(huì)發(fā)生毒力減退和殺蟲(chóng)效率降低等現(xiàn)象。這時(shí)，可將已衰退的菌株去感染菜青蟲(chóng)等的幼蟲(chóng)（相當(dāng)于一種活的選擇性培養(yǎng)基），然后可從病死的蟲(chóng)體內(nèi)重新分離出典型的產(chǎn)毒菌株。如此反復(fù)進(jìn)行多次，就可提高菌株的殺蟲(chóng)效率。淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）有人曾對(duì)Streptomycesmicroflavus“5406”抗生菌的分生孢子，采用－10～－30℃的低溫處理5～7天，使其死亡率達(dá)到80％。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗低溫的存活個(gè)體中，留下了未退化的健壯個(gè)體，從而達(dá)到了復(fù)壯的目的?，F(xiàn)在是13頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四

防止菌種衰退的方法1控制傳代的次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過(guò)程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的次數(shù)）：意即盡量避免不必要的移種和傳代，并將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的幾率。2創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件：在赤霉素生產(chǎn)菌Gebberellafujikuroi的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5′-核苷酸或甘露醇等豐富營(yíng)養(yǎng)物時(shí)，有防止菌種衰退的效果；在A(yíng)spergillusterricola（棲土曲霉）3．942的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施，即從28～30℃提高到33～34℃來(lái)防止它產(chǎn)孢子能力的衰退?，F(xiàn)在是14頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四3利用不同類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代：對(duì)絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種。在放線(xiàn)菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含幾個(gè)核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會(huì)出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用于接種時(shí)，就沒(méi)有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實(shí)踐上創(chuàng)造了用滅過(guò)菌的棉團(tuán)輕巧地對(duì)Streptomycesmi-croflavus“5406”抗生菌進(jìn)行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達(dá)到了防止菌種衰退的效果；又有人發(fā)現(xiàn)，Aspergillusnidulans（構(gòu)巢曲霉）如以其分子孢子傳代就易退化，而改用子囊孢子移種則不易退化?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四4采用有效的菌種保藏方法：在用于工業(yè)生產(chǎn)的菌種中，重要的性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類(lèi)性狀恰是最易退化的。即使在較好的保藏條件下，還是存在這種情況。例如，鏈霉素生產(chǎn)菌——Streptomycesgriseus（灰色鏈霉菌）ЛC-1以冷凍干燥孢子形式經(jīng)過(guò)5年的保藏，在菌群中衰退菌落的數(shù)目有所增加，而在同樣情況下，另一菌株773#只經(jīng)過(guò)23個(gè)月就降低23％的活性。即使在－20℃下進(jìn)行冷凍保藏，經(jīng)12～15個(gè)月后，上述773#菌株和另一種環(huán)絲氨酸生產(chǎn)菌908#菌株的效價(jià)水平還是有明顯降低。由此說(shuō)明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種生產(chǎn)性狀的衰退。現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四（二）微生物菌種保藏技術(shù)1.冷凍干燥或真空干燥保藏；2.超低溫或在液氮中冷凍保藏；3.

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?.土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏?，F(xiàn)在是17頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四1.

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡(jiǎn)單而有效的方法。通過(guò)冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿(mǎn)意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20℃以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。缺點(diǎn)之一：是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四冷凍保藏種類(lèi)

(1)普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)(2)超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60℃～-80℃)(3)液氮冷凍保藏技術(shù)

(-196℃)現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍試管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

某些細(xì)菌和真菌菌種可通過(guò)此法保藏5年而活力不受影響。方法：菌種培養(yǎng)→15~30%甘油緩沖液懸浮→加入保藏管中→置-70℃冰箱保藏措施：低溫（-70℃）、保護(hù)劑（15~50%甘油）適用：細(xì)菌、酵母菌保藏期：約10年

現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四液氮冷凍保藏技術(shù)

方法：菌種培養(yǎng)→保護(hù)劑懸浮→加入保藏管中→置液氮瓶中措施：超低溫（-196℃）、保護(hù)劑適用：各大類(lèi)保藏期：>15年

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過(guò)濾滅菌。

現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四2.

凍干保藏

冷凍干燥的基本方法：是通過(guò)在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一冷凍干燥過(guò)程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國(guó)外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。方法：菌種培養(yǎng)→用保護(hù)劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結(jié)（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→檢查真空度→保藏措施：低溫、干燥，缺氧，有保護(hù)劑適用：各大類(lèi)保藏期：5~15年或更長(zhǎng)現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四培養(yǎng)物的凍干過(guò)程現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四3.其他保藏方法(1)斜面保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏措施：低溫：4℃

適用：各大類(lèi)保藏期：1~6個(gè)月用橡皮塞代替棉塞，可適當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間(2)石蠟油封藏法方法：斜面或半固體接種→培養(yǎng)→加無(wú)菌液蠟高出培養(yǎng)基1cm→4~15℃保藏措施：低溫，隔氧適用：不能利用石油的各大類(lèi)保藏期：1~2年優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四(3)砂土管保藏法方法：孢子或芽孢懸液→加入無(wú)菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：無(wú)營(yíng)養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四4.

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長(zhǎng)非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快。現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有29頁(yè)\編輯于星期四當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)?；蚬?/p>