植物的細(xì)胞培養(yǎng)

植物的細(xì)胞培養(yǎng)第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)、單細(xì)胞的分離與培養(yǎng)一、分離單細(xì)胞的方法

1、物理方法

2、化學(xué)方法

3、酶法第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、物理方法將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經(jīng)搖床不斷振動(dòng)，使細(xì)胞分散。若向細(xì)胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體，細(xì)胞分散的更好。2、化學(xué)方法是在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中加入草酸鹽（能結(jié)合細(xì)胞間質(zhì)中果膠鈣的鈣離子）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（對(duì)細(xì)胞分散有一定的作用）。3、酶法利用果膠酶和纖維素酶使細(xì)胞分離。第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五二、單細(xì)胞的培養(yǎng)方法平板培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)微室培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)）第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、平板培養(yǎng)定義：將一定量細(xì)胞接種到或混合到裝有一薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的方法。第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五技術(shù)要點(diǎn)：?jiǎn)渭?xì)胞懸浮液的制備：先過濾細(xì)胞懸浮液，去掉全部組織塊和大的細(xì)胞團(tuán)，獲得含單細(xì)胞或4-6個(gè)的細(xì)胞團(tuán)的懸浮液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度；固體培養(yǎng)基的制備；接種細(xì)胞：把單細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到瓊脂平板上，鋪成大約1mm的薄層，然后觀察細(xì)胞植板率。第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五植板率：它以能長(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例來表示。優(yōu)點(diǎn)：便于定點(diǎn)觀察；缺點(diǎn)：通氣性較差。植板率(％)＝形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)接種的細(xì)胞數(shù)×100％第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2、看護(hù)培養(yǎng)1953年Muir創(chuàng)立；定義：是指用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，使其持續(xù)分裂和增殖的一種培養(yǎng)方法；具體方法：將單個(gè)細(xì)胞接種于濾紙上，再置于愈傷組織上培養(yǎng)。第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五此法適用于難于培養(yǎng)的植物種類

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、成功率高缺點(diǎn)：不能在顯微鏡下直接觀察第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五3、液體淺層培養(yǎng)

技術(shù)：先將細(xì)胞制成一定密度的細(xì)胞懸浮液，用吸管將懸浮液移到培養(yǎng)皿中形成淺層，一般1mm左右，石蠟?zāi)し饪?，靜置培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：、培養(yǎng)物與空氣接觸面大，通氣性好；

、細(xì)胞代謝產(chǎn)物容易擴(kuò)散，不會(huì)造成有害物質(zhì)的危害；、繼代培養(yǎng)方便、便于觀察。缺點(diǎn)：由于細(xì)胞可以游動(dòng)，不能進(jìn)行定點(diǎn)觀察第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五4、優(yōu)點(diǎn)：可以連續(xù)觀察細(xì)胞的分化和發(fā)育；缺點(diǎn)：通氣性差，水分難保持，pH易變動(dòng)。

第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五5、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（單獨(dú)講解）第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)(suspensionculture):

是指將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五一、懸浮培養(yǎng)的過程：第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五二、懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換；第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五三、懸浮培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)情況分析測(cè)定方法：1、細(xì)胞計(jì)數(shù)：?jiǎn)挝惑w積細(xì)胞濃度；2、細(xì)胞體積：培養(yǎng)物離心后測(cè)定細(xì)胞層所占的體積；3、細(xì)胞鮮重或干重：過濾或干燥后稱重第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五四、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的同步化方法（一）物理方法（二）化學(xué)方法第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、體積選擇法：將培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過一定大小的篩網(wǎng)過濾，對(duì)細(xì)胞按大小分別進(jìn)行收集。2、冷處理法：先收集細(xì)胞，后在低溫（一般為4度）下處理一定時(shí)間后加培養(yǎng)液培養(yǎng)。（一）物理方法第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、饑餓法：控制營養(yǎng)使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，后加營養(yǎng)培養(yǎng)；2、有絲分裂抑制法：向培養(yǎng)液中加入化學(xué)抑制劑抑制細(xì)胞分裂，包括尿苷、秋水仙素（二）化學(xué)方法第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五五、一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較??；均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同；細(xì)胞生長(zhǎng)迅速（2～3天加倍）。第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五六、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法

分批培養(yǎng)法

半連續(xù)培養(yǎng)法

連續(xù)培養(yǎng)法第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五

分批培養(yǎng)法：

●是一種封閉的培養(yǎng)體系，培養(yǎng)過程中不放出培養(yǎng)液，也不補(bǔ)加培養(yǎng)液；

●培養(yǎng)方法：旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)；往返培養(yǎng)；旋轉(zhuǎn)振動(dòng)；攪動(dòng)培養(yǎng)；第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五

在培養(yǎng)過程中，每隔一定時(shí)間更換一部分培養(yǎng)液或添加某種營養(yǎng)成分。

半連續(xù)培養(yǎng)法

連續(xù)培養(yǎng)法

通過控制連續(xù)添加和排出的新老營養(yǎng)液的量，維持培養(yǎng)液體積恒定，據(jù)操作的不同又可分為封閉式和開放式兩種。●封閉式：回收流出的細(xì)胞于培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞數(shù)目增加●開放式：流出的細(xì)胞不回收于培養(yǎng)系統(tǒng)中，但進(jìn)行細(xì)胞收獲第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五七、影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：起始愈傷組織的質(zhì)量；接種細(xì)胞密度；培養(yǎng)條件：方式、溫度；繼代周期。第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五八、細(xì)胞的保存繼代培養(yǎng)保存法：細(xì)胞定期繼代培養(yǎng)，常用；低溫保存法：5－10度溫度下培養(yǎng)并定期更換培養(yǎng)液；冰凍保存法：分為低溫保存（－20度）和超低溫保存（液氮保存）第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

植物細(xì)胞含有人類所需的成分，包括初生代謝物（蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等）和次生代謝物（多酚類、香精油、生物堿、樹脂等），傳統(tǒng)提取分離這些物質(zhì)由于資源短缺和需求量的加大，難以滿足需求，通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物產(chǎn)品成為解決的有效途徑。

第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（一）、細(xì)胞培養(yǎng)的主產(chǎn)品1、藥用代謝產(chǎn)物

生物堿（吡啶、喹啉）、蛋白質(zhì)類（氨基酸、植物抗生素、）、酚類化合物（黃酮類、單酚類、醌類）、萜類化合物（三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜）等。豆杉細(xì)胞紫杉醇（抗癌藥物）紫草細(xì)胞紫草寧（燒傷、痔瘡）例子：第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2、天然食品、食品添加劑色素（胡蘿卜素、葉黃素、單寧）、甜味劑（甜菊苷）、香料物質(zhì)、飲料（可可堿、咖啡堿）等；3、殺蟲劑、殺菌劑萬壽菊細(xì)胞中獲得農(nóng)藥噻吩烷；鷹嘴豆細(xì)胞中得到除蟲菊脂；香草細(xì)胞中分離到魚藤酮?dú)⑾x劑等；4、飼料、精細(xì)化工產(chǎn)品桑細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)蠶飼料銀膠菌細(xì)胞培養(yǎng)橡膠第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（二）、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1、培養(yǎng)細(xì)胞是在無菌條件下生長(zhǎng)的,不受地區(qū)、季節(jié)和氣候限制；2、占地面積少；3、天然產(chǎn)物的生產(chǎn)在控制的條件下進(jìn)行,可以得到超越整體植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物；4、能夠產(chǎn)生原植物所沒有的，甚至是至今在自然界還沒有的化合物。第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（三）、植物細(xì)胞生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器的特點(diǎn)：

在可控制條件下（物理和化學(xué)），細(xì)胞得到大規(guī)模培養(yǎng)（工作體積大），而且單位體積生產(chǎn)能力高。第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、植物細(xì)胞培養(yǎng)特性細(xì)胞本身的特性細(xì)胞培養(yǎng)液的流變特性培養(yǎng)過程的氣體傳遞與影響泡沫與器壁表面黏附性細(xì)胞分裂與愈傷組織的形成懸浮細(xì)胞分批培養(yǎng)生長(zhǎng)特點(diǎn)第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（1）、細(xì)胞本身的特性細(xì)胞體積比微生物細(xì)胞大（10－200μm）,是微生物細(xì)胞的30－100倍；植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢；植物細(xì)胞壁易受機(jī)械剪切力的影響；細(xì)胞常以非均相集合細(xì)胞團(tuán)的方式生長(zhǎng)第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（2）、細(xì)胞培養(yǎng)液的流變特性體現(xiàn)在兩方面：首先，細(xì)胞培養(yǎng)中易結(jié)團(tuán)其次，細(xì)胞培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生黏多糖等物質(zhì)，降低傳氧速度，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。（3）、培養(yǎng)過程的氣體傳遞與影響植物細(xì)胞培養(yǎng)需通過光合作用，植物細(xì)胞都好氧，因此培養(yǎng)過程需注意o2和co2的供應(yīng)及比例關(guān)系。第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（4）、泡沫與器壁表面黏附性：植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中易分泌黏多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)導(dǎo)致黏度增大；植物培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生大量氣泡。對(duì)策：

利用消泡劑和在器皿表面涂抹硅油第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（5）、細(xì)胞分裂與愈傷組織的形成單個(gè)細(xì)胞3－5天內(nèi)可觀察到細(xì)胞分裂，根據(jù)培養(yǎng)的目的不同選取策略：

快繁種苗：細(xì)胞分裂長(zhǎng)成小細(xì)胞團(tuán)后形成小愈傷組織塊，然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

生產(chǎn)細(xì)胞代謝產(chǎn)物：分散細(xì)胞團(tuán)，保持細(xì)胞分裂第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五（6）、懸浮細(xì)胞分批培養(yǎng)生長(zhǎng)特點(diǎn)延遲期：也叫適應(yīng)期，細(xì)胞很少分裂對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞開始分裂，并以幾何級(jí)數(shù)增加減緩期：細(xì)胞分裂減速靜止期（穩(wěn)定期）：生成的和死亡的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到平衡，總數(shù)不變衰亡期：細(xì)胞加快死亡第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2、生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程：1）、細(xì)胞的馴化、篩選與細(xì)胞株的建立

愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)單細(xì)胞的分離（機(jī)械或酶解法）細(xì)胞無性系的分離（過濾涂板培養(yǎng)）細(xì)胞株的篩選（選疏松長(zhǎng)勢(shì)好的細(xì)胞

株，并測(cè)定細(xì)胞代謝物含量）第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五生長(zhǎng)速度快；目的代謝產(chǎn)物含量高；適合懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。適合大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞株應(yīng)具備何條件？第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2）、擴(kuò)大培養(yǎng)逐級(jí)放大，用作培養(yǎng)的種子；細(xì)胞株鑒定：經(jīng)常鑒定，防止細(xì)胞株退化和變異。3）、生物反應(yīng)器培養(yǎng)

培養(yǎng)方式同微生物，可以是分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)。第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2、影響生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素1）、細(xì)胞遺傳特性

取材部位、細(xì)胞株的選擇2）、培養(yǎng)的環(huán)境條件

主要因素包括光照、溫度、攪拌與混合、通氣、營養(yǎng)鹽、pH、調(diào)節(jié)因子第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五3、生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)固定化培養(yǎng)系統(tǒng)第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1）、懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)

類型溶氧破壞性混合度限制因素氣升攪拌式高低均勻細(xì)胞濃度高時(shí)有死角機(jī)械攪拌式中強(qiáng)較均勻細(xì)胞濃度高時(shí)混合不勻鼓泡式中低不均勻有死角，發(fā)生細(xì)胞沉降第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)機(jī)械攪拌式氣升攪拌式第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五2）、固定化培養(yǎng)系統(tǒng)

特點(diǎn)：細(xì)胞固定而培養(yǎng)液循環(huán)流動(dòng)

按照其支持物不同可以分為兩大類：

A、包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺；B、附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維。第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五常見的幾種固定化培養(yǎng)系統(tǒng)流化床生物反應(yīng)器：細(xì)胞包裹在膠粒、泡沫顆粒中，通入空氣使固定化細(xì)胞懸浮于反應(yīng)器中；填充床生物反應(yīng)器：細(xì)胞固定在膠粒、泡沫顆?；蜻B續(xù)的多個(gè)網(wǎng)中，細(xì)胞固定不動(dòng)通過流動(dòng)的培養(yǎng)液傳質(zhì)；膜生物反應(yīng)器：常見的是中空纖維和螺線式卷繞反應(yīng)器，傳質(zhì)效率低，易阻塞，產(chǎn)物收獲較困難，投資大。第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五流化床生物反應(yīng)器填充床生物反應(yīng)器膜生物反應(yīng)器－－－中空纖維思考：固定化有何優(yōu)勢(shì)？第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五(1)固相細(xì)胞接觸緊密,生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞擬組織化,有利于次生產(chǎn)物的積累；(2)細(xì)胞包埋在聚合物中得到保護(hù)，可以減少剪切力的損傷作用；(3)易于把細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，更有利連續(xù)培養(yǎng)及生物轉(zhuǎn)化過程的實(shí)現(xiàn)；固定化細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五(4)高密度的細(xì)胞群體，可建立細(xì)胞間的物理、化學(xué)聯(lián)系，細(xì)胞位置的相對(duì)固定，有利于物化梯度的建立，更有利于產(chǎn)物的合成;(5)環(huán)境條件易于控制，次生代謝物易于釋放。存在的問題：a產(chǎn)物釋放

b氧、養(yǎng)分傳遞第48頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五染色法：如用二乙酸熒光素（FDA）：活細(xì)胞能吸收并降解產(chǎn)生熒光，死亡細(xì)胞則無此現(xiàn)象。呼吸強(qiáng)度測(cè)定法：采用氧電極法測(cè)定；細(xì)胞生長(zhǎng)速率的測(cè)定：對(duì)細(xì)胞數(shù)量或重量進(jìn)行測(cè)定。固定化細(xì)胞活力的測(cè)定：第49頁，共55頁，2023年，2月20日，星期五1、兩步培養(yǎng)技術(shù)二、提高天然產(chǎn)物代謝新技術(shù)1977年Zenk提出：(1)維持培養(yǎng)基(maintenancemedia)

——盡可能快的使細(xì)胞量增長(zhǎng)(