實(shí)驗(yàn)三-血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

一、目的

掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作。了解電泳技術(shù)的一般原理。第一頁，共13頁。二、原理

帶電質(zhì)點(diǎn)向著與它所帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。帶電質(zhì)點(diǎn)之所以能在電場(chǎng)中向一定的方向移動(dòng)，并具有一定的移動(dòng)速度，是取決于帶電質(zhì)點(diǎn)本身所帶的電荷、電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH等因素。蛋白質(zhì)分子在溶液中的電泳是由于蛋白質(zhì)的分子具有一些自由的可解離的基團(tuán)如-COOH、-NH2、-OH等，因而在某種pH值溶液中蛋白質(zhì)分子就帶有一定的電荷。一個(gè)混合的蛋白質(zhì)樣品由于各蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，在相同的pH溶液中所帶的電荷性質(zhì)不同，電荷的數(shù)目不同，在電場(chǎng)中各種蛋白質(zhì)泳動(dòng)的方向和速度也不同，從而使蛋白質(zhì)混合樣品得到分離。第二頁，共13頁。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及形狀不同（見下表），在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同。由表可知，血清中5種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大部分低于pH7.0所以在緩沖液（pH值8.6）中，它們都電離成負(fù)離子，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。蛋白質(zhì)名稱白蛋白α1–球蛋白α2–球蛋白β–球蛋白γ–球蛋白等電點(diǎn)（pI）4.885.065.065.126.85～7.50相對(duì)分子量/Mr6900020000030000090000～150000156000～300000第三頁，共13頁。在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量與結(jié)合的染料量成正比，故可將各蛋白質(zhì)區(qū)帶剪下，分別用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下來，進(jìn)行比色，測(cè)定其相對(duì)含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計(jì)掃描，測(cè)定其相對(duì)含量。本實(shí)驗(yàn)采用的醋酸纖維薄膜電泳，是以醋酸纖維薄膜為支持物的電泳方法。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維醋酸酯。將它溶于有機(jī)溶劑(如：丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后，涂成均勻的薄膜，待溶劑蒸發(fā)后則成為醋酸纖維薄膜。該膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性、其厚度約為120μm。第四頁，共13頁。醋酸纖維薄膜電泳是近幾年來推廣的一種新技術(shù)。它具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高、對(duì)樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結(jié)合球蛋白、同工酶的分離及測(cè)定方面。三、器材1、醋酸纖維薄膜(2×8cm)2、常壓電泳儀3、點(diǎn)樣器(市售或自制)4、培養(yǎng)皿(染色及漂洗用)5、粗濾紙6、玻璃板7、竹鑷第五頁，共13頁。四、試劑1．硼酸緩沖液（PH8.6,離子強(qiáng)度0.075mol/L）硼酸5.6025g，四硼酸納5.6099g，氯化鈉1.3163g，加蒸餾水至1000mL2．染色液300mL含氨基黑10B0．25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL,水40mL(可重復(fù)使用)。3．漂洗液2000mL含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL。4.透明液(現(xiàn)用現(xiàn)配）無水乙醇:冰醋酸＝7:3第六頁，共13頁。五、操作1．浸泡用鑷子取醋酸纖維薄膜1張（8*2cm），識(shí)別出光澤面與無光澤面，并在角上用筆做上點(diǎn)樣線（膜條一端1.5cm處，用鉛筆橫畫一條線）放在巴比妥緩沖液中浸泡20分鐘。整條薄膜一致而無白點(diǎn)，則表明薄膜質(zhì)地均勻(實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選擇質(zhì)地均勻的膜)第七頁，共13頁。2．點(diǎn)樣把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后平鋪在玻璃板上(無光澤面朝上)。取一滴樣品（血清）放置在載玻片上，用蓋玻片的一端截面（玻璃寬度應(yīng)小于薄膜的寬度），沾適量的樣品（樣品吸附高度約1-2mm，高度均一。），然后將其截面與薄膜上點(diǎn)樣線處輕輕水平地落下并隨即提起，樣品呈一條線“印”在薄膜上，使樣品盡量點(diǎn)得細(xì)窄而均勻，這樣即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血清樣品。第八頁，共13頁。3．電泳在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個(gè)電極槽內(nèi)的液面等高，將將點(diǎn)好樣的薄膜(無光澤面朝下)兩端平懸于電泳槽支架的濾紙橋(先剪裁尺寸合適的濾紙條，取雙層濾紙條附著在電泳槽的支架上，使它的一端與支架的前沿對(duì)齊，而另一端浸入電極槽的緩沖液內(nèi)。用緩沖液將濾紙全部潤(rùn)濕并驅(qū)除氣泡，使濾紙緊貼在支架上，即為濾紙橋，它是聯(lián)系醋酸纖維薄膜和兩極緩沖液之間的“橋梁”。)上。膜條上點(diǎn)樣的一端靠近負(fù)極。蓋嚴(yán)電泳室。平衡10min后，通電。調(diào)節(jié)電壓至160V，電流強(qiáng)度0．4～0．7mA／cm(毫安／厘米)膜寬，電泳時(shí)間約為60分鐘。第九頁，共13頁。4．染色電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡10分鐘。5．漂洗將膜條從染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗數(shù)次（3-4次，每次5min）至無蛋白區(qū)底色脫凈為止，用濾紙吸取多余液體，可得色帶清晰的電泳圖譜。6.透明將干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡2~3min后取出貼于潔凈玻璃板上，干后即為透明的薄膜圖譜，可用光密度計(jì)直接測(cè)定。第十頁，共13頁。六、注意事項(xiàng)1、保持醋酸纖維素薄膜的清潔，避免用手直接接觸薄膜。2、點(diǎn)樣量要適宜，2次左右即可，蓋玻片的邊緣應(yīng)避免出現(xiàn)明顯液滴。點(diǎn)樣要盡量點(diǎn)在一條直線上。（此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,點(diǎn)樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí),掌握點(diǎn)樣技術(shù)后再正式點(diǎn)樣。）3、電泳時(shí)間不低于1小時(shí)。4、點(diǎn)樣處不要搭在濾紙上，以免血清滲入濾紙。5、醋酸纖維素薄膜應(yīng)繃直，避免電泳槽隔離板的干擾。6、不可同時(shí)接觸正負(fù)極，防止觸電。第十一頁，共13頁。結(jié)果分析：1、區(qū)帶不分離，沒有出現(xiàn)理論上的5條帶。原因：電泳時(shí)間不夠，電壓偏低，點(diǎn)樣量過多。2、區(qū)帶不清晰，顏色很淺。原因：點(diǎn)樣量不夠。3