氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的原理及應(yīng)用

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的原理及應(yīng)用第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五主要內(nèi)容1氣質(zhì)聯(lián)用的原理2常見的氣質(zhì)聯(lián)用儀器及色譜柱3樣品處理4氣質(zhì)聯(lián)用參數(shù)設(shè)置5氣質(zhì)聯(lián)用對本課題組的意義第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五氣質(zhì)聯(lián)用的原理氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測物質(zhì)各組分在不同兩相間分配系數(shù)（溶解度）的微小差異，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，使原來只有微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生很大的效果，而使不同組分得到分離。實(shí)際為通過樣品組份沸點(diǎn)之間的差異先后進(jìn)柱，然后在氣體流動(dòng)相和固定相之間分配系數(shù)的差異進(jìn)一步分離。質(zhì)譜作為氣相色譜的檢測器，利用電離源將各種成分分子電離成質(zhì)譜碎片，通過相應(yīng)的譜庫檢索碎片信息，給出此信息與某化學(xué)物質(zhì)匹配度，達(dá)到對物質(zhì)進(jìn)行定性的目的。第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五氣質(zhì)聯(lián)用組成構(gòu)建第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五常見的氣質(zhì)聯(lián)用儀目前常用的是美國Agilent的和日本島津的聯(lián)用儀，其中Agilent為公認(rèn)的分析測量儀器生產(chǎn)廠家。型號有6890N/5973C、7890N/5975C等第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五6890N/5973C第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五色譜柱常用的色譜柱包括毛細(xì)管柱和填充柱。第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五毛細(xì)管柱的參數(shù)及選擇原則內(nèi)徑：0.25mm最常用的內(nèi)徑規(guī)格。有較高的柱效，負(fù)荷量較低，必須分流進(jìn)樣或無分流進(jìn)樣。用于復(fù)雜多組份樣品分析。

大口徑，多固定相大樣品容量，分離能力降低，流失較大。柱長：25—30m中長柱：分離10—50個(gè)組份的樣品。

50m長柱：分離大于50個(gè)組份或包含有難分離物質(zhì)對的復(fù)雜樣品。加倍柱長，恒溫分析時(shí)間則加倍但峰分辨率僅增大40%。如果分析只是比較好但不是特別好的，有比增加柱長度更好的辦法來分析結(jié)果，如考慮更薄的膜，優(yōu)化載氣流量或用程序升溫等。膜厚：

0.25—0.33um標(biāo)準(zhǔn)液厚一般商品柱的標(biāo)準(zhǔn)液膜。對于流出達(dá)300℃的大多數(shù)樣品（包括蠟、甘油三酯、甾族化合物等）能夠很好的分析。毛細(xì)管固定液第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五毛細(xì)管柱的固定液選擇原則

---“相似相溶”

a.非極性物質(zhì)—非極性固定液。沸點(diǎn)越低的組分越早出峰。b.極性物質(zhì)—極性固定液。極性越小的組分出越早出峰。c.極性與非極性混合物—極性固定液。極性越小的組分出越早出峰。d.易形成氫鍵物質(zhì)—極性或氫鍵型固定液。不易形成氫鍵的組分先出峰，易形成氫鍵的組分后出峰。e.復(fù)雜難分離樣品—多種固定液混合。第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五常用毛細(xì)管柱固定液

第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五樣品的處理樣品要求溶解在有機(jī)溶劑（如丙酮、正己烷、氯仿、苯等）中；溶劑應(yīng)具有較低的沸點(diǎn)，從而使其容易與樣品分離。盡可能避免用水、二氯甲烷和甲醇做溶劑，因?yàn)樗鼈儗ρ娱L色譜柱的使用壽命不利。另外，如果用毛細(xì)管柱分析，應(yīng)注意樣品的濃度不要太高，以免造成柱超載，通常樣品的濃度為mg/ml級或更低。樣品中不能含有水，鹽類等物質(zhì)；GC所能直接分離的樣品應(yīng)是可揮發(fā)的、且是熱穩(wěn)定的，沸點(diǎn)一般不超過500℃，分子量小于500；樣品含量在ppb-ppm級，樣品不得少于20uL；需要進(jìn)行衍生化處理的樣品，需合理選擇衍生化方法。第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五樣品的衍生化衍生化目的：改善待測物質(zhì)的氣相色譜性質(zhì)、熱穩(wěn)定性、分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為，引入鹵素原子或吸電子基團(tuán)，通過一些特殊的衍生化方法可以拆分一些難分離的手性化合物。常用的衍生化方法：硅烷化衍生化（1）BSTFA和BTA衍生化胺基和羥基（2）MTBSTFA常用于藥物、類固醇類檢測（3）MSTFA是最常用的硅烷化試劑（蘋果酸、富馬酸、檸檬酸等）（4）單糖硅烷化時(shí)用一般用三甲基硅烷咪唑（甘露糖、半乳糖、海藻糖等）酰化衍生化（1）乙?；w內(nèi)藥物篩選，大多數(shù)的臨床藥物）（2）三氟乙酰化/五氟丙?；?七氟丁?；ū奖奉惡吐辄S堿類）烷基化衍生化（農(nóng)藥和殺蟲劑）第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五氣質(zhì)聯(lián)用參數(shù)設(shè)置

----進(jìn)樣方式動(dòng)進(jìn)樣（auto-injector）和手動(dòng)進(jìn)樣；自動(dòng)進(jìn)樣包括填充柱進(jìn)樣口、毛細(xì)柱分流/無分流進(jìn)樣口、冷柱頭進(jìn)樣、程序升溫（PTV）進(jìn)樣口、大體積進(jìn)樣、閥進(jìn)樣。第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五是否分流？分流（split）主要組分分析；脈沖分流（pulsesplit）允許更大進(jìn)樣量；不分流（splitless）痕量組分分析；脈沖組分不分流（pulsesplitless）允許更大進(jìn)樣量。良好的分流比可以防止柱內(nèi)某些成分含量過高，造成柱超載形成拖尾峰影響分離，使出峰時(shí)間相近的成分能夠較好的分離。分流不改變樣品濃度，只改變峰的信號強(qiáng)度。Splitratio(分流比)10:1即為11份，1份進(jìn)柱子，10份流失。第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五分流進(jìn)樣注意事項(xiàng)分流進(jìn)樣時(shí)為了保證分流比的概念真實(shí)有效，樣品（溶劑+被分析物）必須與載氣充分混合，形成一個(gè)均勻的混合物。如果進(jìn)樣量過大，溶劑會(huì)膨脹為很大的體積，致使進(jìn)樣口襯管過載。其結(jié)果必將導(dǎo)致樣品從吹掃出口流出而造成樣品損失，同時(shí)也會(huì)造成載氣輸入管路的污染。第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五進(jìn)樣（氣化）室溫度

考慮樣品的穩(wěn)定性？樣品是否能夠氣化？一般在200~250℃考慮樣品中各組分的沸點(diǎn)，設(shè)定溫度使樣品瞬間汽化。進(jìn)樣后要有足夠的氣化溫度，使液體式樣迅速氣化后被載氣帶入柱中。在保證樣品不分解的情況下，適當(dāng)提高氣化溫度對分離及定量有利，尤其當(dāng)進(jìn)樣量大時(shí)更是如此。一般選擇氣化溫度比柱溫高30-70℃。第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五色譜柱程序升溫條件

程序升溫條件是影響樣品分離度的最主要因素。根據(jù)樣品的揮發(fā)性等改變；程序升溫慢可改善分離效果，但會(huì)增加分析的時(shí)間；柱溫不能高于固定液的最高使用溫度，否則固定液揮發(fā)流失；應(yīng)綜合考慮。升溫速率快會(huì)加快載氣流速，也會(huì)使載氣攜帶組分過快流出，導(dǎo)致保留值相近的組分難以完全分離。柱溫提高，會(huì)使各組分的揮發(fā)靠攏，不利于分離，柱溫不能太低，被測組分在兩相間擴(kuò)散速率大為減小，分配不能迅速達(dá)到平衡，峰形變寬，柱效下降，并延長了分析時(shí)間。第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五程序升溫選擇原則在使最難分離的組分能盡可能好的分離的情況下，盡可能采取較低的柱溫，但以保留時(shí)間適宜，峰形不拖尾為度。對于高沸點(diǎn)混合物（300-400℃），希望在較低的柱溫下（低于其沸點(diǎn)100-200℃）分析，為改善液相傳質(zhì)速率，可用低固定液含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%-3%）的色譜柱，使液膜薄一些，但允許最大進(jìn)樣量減小，因此應(yīng)采用高靈敏度檢測器。對于沸點(diǎn)不太高的混合物（200-300℃），可在中等柱溫下操作，固定液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%-10%，柱溫比其平均沸點(diǎn)低100℃。對于沸點(diǎn)在100-200的混合物，柱溫可選在其平均沸點(diǎn)的2/3左右，固定液質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%-15%。對于氣體，氣態(tài)烴等低沸點(diǎn)混合物，柱溫選在其沸點(diǎn)或沸點(diǎn)以上，以便能在室溫或50以下分析。固定液質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在15%-20%。第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五質(zhì)譜電離方式

離子源的作用是將被分析的樣品分子電離成帶電的離子，并使這些離子在離子光學(xué)系統(tǒng)的作用下，會(huì)聚成有一定幾何形狀和一定能量的離子束，然后進(jìn)入質(zhì)量分析器被分離。

EI電子電離源：主要分析揮發(fā)性樣品，GC-MS標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖NIST譜庫。國際上統(tǒng)一用70eV，在這一電子能的作用下可形成最多的離子，可形成相對大的分子離子峰和強(qiáng)的碎片離子峰（與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)）。有些化合物的分子離子不出現(xiàn)或很弱。MSsourcetemperature230℃。

CI化學(xué)電離源：軟電離技術(shù)，EI有些分析不了，CI可以分析易氣化樣品的分析，GC-MS非標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，不能譜庫檢索。FAB快原子轟擊源：極性強(qiáng)，分子量大難氣化的樣品的分析。ESI電噴霧電離源:液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，軟電離方式，適合于分析極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物。APCI大氣壓化學(xué)電離源：中等極性的有機(jī)化合物，是ESI的補(bǔ)充，得準(zhǔn)分子離子，單電荷離子。第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五EI源的優(yōu)、缺點(diǎn)

1結(jié)構(gòu)簡單、溫控和操作均較方便2電離效率高、所形成的離子動(dòng)能分散小3性能穩(wěn)定、所得譜圖是特征的、能表征組分的分子結(jié)構(gòu)（目前大量的有機(jī)物標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖均是用EI源得到的）4樣品必能氣化，不適于難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的樣品5有的化合物在EI方式下分子離子不穩(wěn)定、易碎裂，得不到分子量信息，譜圖復(fù)雜解釋有一定困難6EI方式只檢測正離子，不檢測負(fù)離子第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五質(zhì)量檢測器第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五數(shù)據(jù)采集模式

全掃描模式（Scan）和選擇離子模式（SIM）SIM比Scan的靈敏度高三個(gè)數(shù)量級。全掃描模式是在色譜運(yùn)行期間連續(xù)獲得的，記錄的強(qiáng)度既是時(shí)間（色譜信息）又是質(zhì)量（質(zhì)譜信息）的函數(shù)。選擇離子模式中，靈敏度可通過僅檢測少數(shù)幾個(gè)選定的m/z成比例地增加記錄時(shí)間的辦法加以增強(qiáng)。提高靈敏度、改善峰型和精確度。用于痕量分析、復(fù)雜機(jī)制和常規(guī)定量。閾值的設(shè)置：數(shù)據(jù)采集時(shí)，為限制采集的峰數(shù)，可以根據(jù)本底噪聲的信號水平設(shè)置一個(gè)閾值，計(jì)算機(jī)采集數(shù)據(jù)時(shí)，只有強(qiáng)度大于或等于閾值的信號才會(huì)被保留下來。第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五譜圖分析---定性分析主要是庫檢索，再結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，一般匹配度應(yīng)高于80以上，庫檢索一般為PBM檢索，不用化學(xué)工作站檢索。第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五常用的譜庫NIST庫：美國國家科學(xué)技術(shù)研究所出版。NIST/EPA/NIH庫：美國國家科學(xué)技術(shù)研究所、美國環(huán)保局、美國國立衛(wèi)生研究院共同出版。Wiley庫:3個(gè)版本，同一化合物可能有重復(fù)的不同來源的質(zhì)譜圖。農(nóng)藥庫、藥物庫、揮發(fā)油庫。前三個(gè)通用，后三個(gè)專用，NIST/EPA/NIH庫應(yīng)用最廣泛。第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五使用庫檢索注意問題

1電離條件：EI源，70eV電子束轟擊。2被檢索的質(zhì)譜圖應(yīng)該是純化合物的質(zhì)譜圖，扣除背景干擾對檢索是否正確十分重要?，F(xiàn)在的質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)都帶有本底扣除功能，關(guān)鍵是本底的選擇是否正確。3在總離子流圖中選擇哪次掃描的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索,對檢索結(jié)果有影響。4匹配度(相似度)最高的化合物不一定就是要檢索的化合物，還要考慮其他有關(guān)信息。譜庫檢索的好壞除了與譜庫中譜圖的數(shù)量和參考譜圖的質(zhì)量外，最重要的是待鑒定的未知物譜圖是否正確。第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五

儀器調(diào)諧方式不對，或數(shù)據(jù)采集時(shí)最強(qiáng)峰超量程，因此采集的譜圖中離子的相對強(qiáng)度不對。②采集數(shù)據(jù)或處理譜圖時(shí)設(shè)定的低質(zhì)量范圍過高，重要的低質(zhì)量特征峰沒出現(xiàn)。③色譜分離不好，得到的不是單一組分的質(zhì)譜圖，或本底峰干擾嚴(yán)重。④譜圖處理不當(dāng)，得到的譜圖質(zhì)量不高。一個(gè)色譜峰可以有多張質(zhì)譜圖，使用平均譜或任一張譜圖，選擇是否正確，背景扣除是否正確，都影響譜圖質(zhì)量。⑤檢索參數(shù)的選擇（如質(zhì)量范圍等）是否正確。影響檢索結(jié)果的原因

第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五譜圖分析---定量分析定量方法有面積歸一化法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法(internalstandardmethod)。第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五面積歸一化法面積歸一化法中各組分濃度以面積百分率表示，該結(jié)果可以確認(rèn)大概的濃度，但有誤差。優(yōu)點(diǎn)：1）無需做校正，簡便，快速2）進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求缺點(diǎn)：1）所有組分都流出且被檢測到2）所有組分的檢測靈敏度都相同要求：所有物質(zhì)都出峰，各物質(zhì)響應(yīng)因子比較接近，且主要物質(zhì)含量足夠大，各峰型都比較尖銳且對稱；峰高，只要不超過檢測的線性范圍最大值的一半就行。第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五外標(biāo)法外標(biāo)法是目前應(yīng)用最廣泛的方法之一，其誤差來源主要是進(jìn)樣誤差，分析前一定要做面積重復(fù)性（即進(jìn)樣重復(fù)性）實(shí)驗(yàn)。優(yōu)點(diǎn)：1）不需所有峰都流出或被檢測到2）只對所測組分作校正缺點(diǎn)：1）進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確2）儀器必須有良好的穩(wěn)定性第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法指在樣品中添加內(nèi)標(biāo)物，通過組分與內(nèi)標(biāo)峰的面積比，對組分進(jìn)行定量。能減少進(jìn)樣誤差對定量結(jié)果的影響。優(yōu)點(diǎn)：1）進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求2）只對所測組分作校正缺點(diǎn)：1）必須在樣品中加一內(nèi)標(biāo)組分2）操作較為繁瑣3）選擇內(nèi)標(biāo)物困難內(nèi)標(biāo)物的選擇原則：內(nèi)標(biāo)物的峰與試樣中的所有成分的峰完全分離。內(nèi)標(biāo)物的峰與目標(biāo)成分的峰保留時(shí)間不應(yīng)差太遠(yuǎn)。內(nèi)標(biāo)物具有與分析目標(biāo)成分類似的化學(xué)性質(zhì)。加入等體積等濃度的內(nèi)標(biāo)物，即事先配好內(nèi)標(biāo)溶液（等濃度），然后在每個(gè)待測樣品中加入等體積的內(nèi)標(biāo)溶液，需要稱重以確保加入相同量的純內(nèi)標(biāo)物。加入相同量的內(nèi)標(biāo)是指加入后各對照液內(nèi)標(biāo)的濃度相等。ppm用溶質(zhì)質(zhì)量占全部溶液質(zhì)量的百萬分比來表示的濃度,也稱百萬分比濃度。第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五三種定量方法均要求對各色譜峰進(jìn)行積分，質(zhì)譜工作站通過兩種積分方式，即RTE積分器（RTEIntegrator）和化