重組體克隆的篩選和鑒定

現(xiàn)在是1頁\一共有90頁\編輯于星期二第七章

重組體克隆的篩選和鑒定現(xiàn)在是2頁\一共有90頁\編輯于星期二一、抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。

Tetr上有插入位點BamHI和SalI;Ampr上有插入位點PstI。第一節(jié)

載體表型選擇法1.原理：現(xiàn)在是3頁\一共有90頁\編輯于星期二pBR322現(xiàn)在是4頁\一共有90頁\編輯于星期二（1）四環(huán)素：（2）氨芐青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素標(biāo)記選擇產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌。（3）環(huán)絲氨酸：現(xiàn)在是5頁\一共有90頁\編輯于星期二3.選擇過程：如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活現(xiàn)在是6頁\一共有90頁\編輯于星期二無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基現(xiàn)在是7頁\一共有90頁\編輯于星期二（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇?，F(xiàn)在是8頁\一共有90頁\編輯于星期二二、-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)++深藍(lán)色1.原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（

片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的-半乳糖苷酶?，F(xiàn)在是9頁\一共有90頁\編輯于星期二假陽性：如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒有中止密碼；（不破壞肽）。2.選擇過程現(xiàn)在是10頁\一共有90頁\編輯于星期二-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物?，F(xiàn)在是11頁\一共有90頁\編輯于星期二利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直接選擇。（只在特定條件下）。轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。一、原理：第二節(jié)

根據(jù)插入基因的表型選擇1.彌補缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長現(xiàn)在是12頁\一共有90頁\編輯于星期二小鼠的二輕葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2.增加新性狀現(xiàn)在是13頁\一共有90頁\編輯于星期二利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。第三節(jié)DNA電泳檢測法

分子量Marker載體重組克隆現(xiàn)在是14頁\一共有90頁\編輯于星期二二、酶切電泳篩選法1.原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度）。或用合適的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果?，F(xiàn)在是15頁\一共有90頁\編輯于星期二ABA或B現(xiàn)在是16頁\一共有90頁\編輯于星期二現(xiàn)在是17頁\一共有90頁\編輯于星期二不同克隆的酶切結(jié)果現(xiàn)在是18頁\一共有90頁\編輯于星期二篩選過程現(xiàn)在是19頁\一共有90頁\編輯于星期二三、PCR擴增檢測法1.原理PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷。2.過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。現(xiàn)在是20頁\一共有90頁\編輯于星期二1.核酸雜交第四節(jié)

核酸雜交檢測法

一、原理：重組克隆與探針雜交。3.識別標(biāo)記32P或

125I。（1）放射性同位素2.檢測用的探針與外源DNA插入片斷互補的序列。（2）非放射性標(biāo)記熒光素現(xiàn)在是21頁\一共有90頁\編輯于星期二二、核酸雜交檢測方法用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。1.Southernblotting從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。現(xiàn)在是22頁\一共有90頁\編輯于星期二酶切前酶切后插入片斷載體現(xiàn)在是23頁\一共有90頁\編輯于星期二Southernblot篩選結(jié)果現(xiàn)在是24頁\一共有90頁\編輯于星期二（1）原位雜交篩選特點：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落?，F(xiàn)在是25頁\一共有90頁\編輯于星期二現(xiàn)在是26頁\一共有90頁\編輯于星期二（2）R-環(huán)檢測法DNA-RNA雜交。1）原理：2）選擇過程在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見一種R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。用外源基因的mRNA與重組載體雜交?，F(xiàn)在是27頁\一共有90頁\編輯于星期二缺點：需要電鏡！現(xiàn)在是28頁\一共有90頁\編輯于星期二2.Northernblotting用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交?，F(xiàn)在是29頁\一共有90頁\編輯于星期二利用抗體作為“探針”來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：一、放射性抗體檢測法第五節(jié)

免疫化學(xué)檢測法

1.抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對表達(dá)產(chǎn)物的檢測。蛋白——蛋白“雜交”

現(xiàn)在是30頁\一共有90頁\編輯于星期二待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗現(xiàn)在是31頁\一共有90頁\編輯于星期二2.放射性抗體檢測法過程現(xiàn)在是32頁\一共有90頁\編輯于星期二3.Broome-Gilbert雙位點檢測法質(zhì)?；駻插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白檢測融合蛋白。既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。現(xiàn)在是33頁\一共有90頁\編輯于星期二固相支持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光現(xiàn)在是34頁\一共有90頁\編輯于星期二二、免疫沉淀檢測法把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。1.原理抗原——抗體凝集反應(yīng)。檢測分泌型產(chǎn)物。2.方法現(xiàn)在是35頁\一共有90頁\編輯于星期二對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）?，F(xiàn)在是36頁\一共有90頁\編輯于星期二三、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理：一抗（primaryantibody）:

與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二抗（secondaryantibody）：

與一抗的特異性結(jié)合。酶連（enzyme-linke）：

二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標(biāo)分子的含量?，F(xiàn)在是37頁\一共有90頁\編輯于星期二待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶

待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶

19現(xiàn)在是38頁\一共有90頁\編輯于星期二2.ELISA檢測的一般步驟（1）固定樣品將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎赚F(xiàn)在是39頁\一共有90頁\編輯于星期二加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。（2）一抗結(jié)合一抗現(xiàn)在是40頁\一共有90頁\編輯于星期二加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗結(jié)合二抗現(xiàn)在是41頁\一共有90頁\編輯于星期二加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。（4）顯色反應(yīng)現(xiàn)在是42頁\一共有90頁\編輯于星期二現(xiàn)在是43頁\一共有90頁\編輯于星期二在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。（5）比色現(xiàn)在是44頁\一共有90頁\編輯于星期二3.ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）現(xiàn)在是45頁\一共有90頁\編輯于星期二臨床檢驗常用的單抗現(xiàn)在是46頁\一共有90頁\編輯于星期二臨床檢驗常用的單抗現(xiàn)在是47頁\一共有90頁\編輯于星期二

蛋白質(zhì)印跡(westernblot)，又稱免疫印跡(immunoblotting)是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。

WesternBlot基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況。WesternBlot采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。四、WesternBlot?，F(xiàn)在是48頁\一共有90頁\編輯于星期二(1)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer①PAGE現(xiàn)在是49頁\一共有90頁\編輯于星期二點樣電泳方向現(xiàn)在是50頁\一共有90頁\編輯于星期二②蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓現(xiàn)在是51頁\一共有90頁\編輯于星期二DaltonSDSPAGE現(xiàn)在是52頁\一共有90頁\編輯于星期二③凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。

硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。1）直接染色現(xiàn)在是53頁\一共有90頁\編輯于星期二直接染色電泳結(jié)果現(xiàn)在是54頁\一共有90頁\編輯于星期二（2）Westernblotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。①Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白現(xiàn)在是55頁\一共有90頁\編輯于星期二Western裝置現(xiàn)在是56頁\一共有90頁\編輯于星期二②Blotting原理與ELISA相同。待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光PAGE膠待測蛋白底片曝光辣根過氧化物酶：HRPO現(xiàn)在是57頁\一共有90頁\編輯于星期二現(xiàn)在是58頁\一共有90頁\編輯于星期二1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與

膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。③Blotting過程ImmunoBlotting現(xiàn)在是59頁\一共有90頁\編輯于星期二④結(jié)果:多克隆抗體Blotting的結(jié)果單抗blotting結(jié)果現(xiàn)在是60頁\一共有90頁\編輯于星期二一、無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)第六節(jié)

轉(zhuǎn)譯篩選法

能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。借助無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因?，F(xiàn)在是61頁\一共有90頁\編輯于星期二二、轉(zhuǎn)譯篩選mRNA無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)記的甲硫氨酸翻譯35S標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？現(xiàn)在是62頁\一共有90頁\編輯于星期二三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。單鏈mRNA核糖體小亞基核糖體大亞基能翻譯mRNADNA核糖體小亞基核糖體大亞基不能翻譯1.原理現(xiàn)在是63頁\一共有90頁\編輯于星期二2.過程現(xiàn)在是64頁\一共有90頁\編輯于星期二四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法1.原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應(yīng)的mRNA，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。現(xiàn)在是65頁\一共有90頁\編輯于星期二2.過程硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA總mRNAcDNA基因的mRNA雜交洗脫cDNA基因的mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編碼的蛋白硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA收集35S標(biāo)記的氨基酸現(xiàn)在是66頁\一共有90頁\編輯于星期二專門設(shè)計檢測能同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用篩選法現(xiàn)在是67頁\一共有90頁\編輯于星期二一般克隆與篩選策略現(xiàn)在是68頁\一共有90頁\編輯于星期二第七節(jié)

幾種常用的真核生物重組基因選擇方法真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK選擇原理①四氫葉酸的必要性DHFR現(xiàn)在是69頁\一共有90頁\編輯于星期二②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP

dATP

TTP

dCTP

氨甲喋啉

抑制

抑制

現(xiàn)在是70頁\一共有90頁\編輯于星期二④胸苷酸激酶的補救作用TK+細(xì)胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成TTP，存活。Ttk③次黃嘌呤的補救作用細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP

dATP

TTP

dCTP

次黃嘌呤

補救

氨甲喋啉

抑制

抑制

現(xiàn)在是71頁\一共有90頁\編輯于星期二①HAT培養(yǎng)基：Tk-

細(xì)胞株。TK基因。②宿主細(xì)胞③載體標(biāo)記（2）TK選擇過程含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有轉(zhuǎn)入TK基因的細(xì)胞才能生存?，F(xiàn)在是72頁\一共有90頁\編輯于星期二20現(xiàn)在是73頁\一共有90頁\編輯于星期二真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。2.二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（1）

選擇原理①二氫葉酸還原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸現(xiàn)在是74頁\一共有90頁\編輯于星期二DHFR+細(xì)胞二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存不需要補救！現(xiàn)在是75頁\一共有90頁\編輯于星期二DHFR-

細(xì)胞DHFR-

細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。需要補救！不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存?，F(xiàn)在是76頁\一共有90頁\編輯于星期二②胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤補救胸苷補救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救:現(xiàn)在是77頁\一共有90頁\編輯于星期二DHFR-細(xì)胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生長）。①

宿主細(xì)胞（2）選擇過程透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補救。②

無核苷酸的培養(yǎng)基需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救！現(xiàn)在是78頁\一共有90頁\編輯于星期二③

氨甲喋呤“加壓”添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補救作用，可提高選擇。DHFR+基因。④載體標(biāo)記只有轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細(xì)胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie無核苷酸的培養(yǎng)基現(xiàn)在是79頁\一共有90頁\編輯于星期二是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，使細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行，但不影響真核生物。3.新霉素抗性基因（neor）（1）選擇原理①新霉素（neomycin）新霉素的類似物，是一種

氨基糖苷，對真核細(xì)胞和原核細(xì)胞都有毒性。②G418（geneticin）現(xiàn)在是80頁\一共有90頁\編輯于星期二③新霉素抗性基因--neor細(xì)菌的新霉素抗性基因（neor）編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH），能使G418失活。G418真核細(xì)胞死亡G418存活neor真核細(xì)胞現(xiàn)在是81頁\一共有90頁\編輯于星期二含致死劑量G418的完全培養(yǎng)基。①G418培養(yǎng)基真核細(xì)胞株均可。neor基因。②宿主細(xì)胞③載體標(biāo)記（2）選擇過程G418：（100-800g/mL）現(xiàn)在是82頁\一共有90頁\編輯于星期二CAT是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼的，催化氯霉素發(fā)生乙酰化失活。氯霉素cat含氯霉素的完全培養(yǎng)基。真核細(xì)胞株均可。cat基因。乙酰氯霉素4.氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）（1）選擇原理（2）

選擇條件（3）

宿主細(xì)胞（4）載體標(biāo)記chloramphenicolacetyltransferase現(xiàn)在是83頁\一共有90頁\編輯于星期二在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提取物中測定是否有乙酰氯霉